肿瘤靶向性VEGF-SLC融合蛋白的原核表达及活性鉴定

发布时间：2018-05-21 02:14

  本文选题：肿瘤靶向治疗 + VEGF-SLC融合蛋白　； 参考：《重庆医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的: 为了将肺癌靶向治疗和自体免疫增强疗法相结合,本研究扩增血管内皮生长因子(VEGF)和次级淋巴组织趋化因子(SLC)的融合基因,构建VEGF-SLC融合基因的原核表达质粒pQE30-VEGF-SLC,在E.coli中高效表达和纯化重组VEGF-SLC融合蛋白,并在体外检测其生物学活性,为研究和开发新型靶向肿瘤生物制剂奠定基础。 方法: 1.以A549细胞mRNA为模板,RT-PCR扩增VEGF基因片段,以pET32a(+)/SLC质粒为模板,PCR扩增SLC基因片段,再以Gene SOEing法扩增VEGF-SLC融合基因,然后将其插入原核表达质粒pQE30中,构建重组质粒pQE30-VEGF-SLC。重组质粒经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化E.coli M15,用IPTG诱导目的基因表达。Western bolt鉴定后,采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,然后采取逐步降低尿素浓度的方法使重组蛋白复性。 2.用不同浓度梯度的重组蛋白及阴性对照包被96孔板,经封闭洗涤后分别与A549细胞和对照MRC-5共培养1h,结晶紫染色,观察重组蛋白VEGF-SLC对细胞的粘附情况,通过细胞粘附实验评价重组蛋白的肿瘤靶向性。 3.将不同浓度梯度的重组蛋白及阴性对照加到96孔板中,每组各设3复孔,每孔上室加入人外周血淋巴细胞悬液孵育4h后,显微镜下观察细胞迁移情况并计数,计算趋化指数,通过趋化实验检测重组蛋白对外周血淋巴细胞的趋化能力。 结果: 1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pQE30-VEGF-SLC原核表达质粒构建成功;将重组质粒转化大肠杆菌M15后、经IPTG诱导表达,获得了重组VEGF-SLC融合蛋白(rVEGE-SLC)。融合蛋白经SDS-PAGE分析,分子量约为28KDa,主要以包涵体形式存在,通过6×His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,重组蛋白纯度达90%以上。 2.在细胞粘附实验中,被rVEGF-SLC融合蛋白包被的孔内明显有A549细胞粘附。粘附的细胞数量随rVEGF-SLC融合蛋白浓度增加而增多。阴性对照孔和MRC-5对照细胞孔无明显细胞粘附。 3.在趋化实验中,rVEGF-SLC融合蛋白能引起人外周血淋巴细胞发生明显的迁移,并在3μg/L时达到最大趋化指数。 结论: 1.成功构建pQE30-VEGF-SLC原核表达质粒,且能在大肠杆菌M15中高效表达重组VEGF-SLC融合蛋白,为探索肿瘤生物治疗新途径奠定了基础。 2. rVEGF-SLC融合蛋白在体外对人肺腺癌A549细胞具有明显的粘附作用,但是对人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞(非肿瘤对照细胞)且无明显粘附效应,证实了其肿瘤靶向性;趋化实验证实,rVEGF-SLC融合蛋白对人外周血淋巴细胞具有明显的趋化效应。因此,本实验重组表达的rVEGF-SLC融合蛋白兼具天然VEGF和SLC各自的生物学活性。该肿瘤靶向性融合蛋白的制备和研究,为探索肺癌及其它肿瘤的靶向治疗和免疫治疗综合途径奠定了基础。
[Abstract]:Objective: In order to combine lung cancer targeting therapy with autologous immunoenhancement therapy, the fusion genes of vascular endothelial growth factor (VEGF) and secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) were amplified. The prokaryotic expression plasmid pQE30-VEGF-SLC of VEGF-SLC fusion gene was constructed. The recombinant VEGF-SLC fusion protein was highly expressed and purified in E.coli. The biological activity of pQE30-VEGF-SLC was detected in vitro, which laid a foundation for the research and development of novel targeted tumor biological agents. Methods: 1. The VEGF gene fragment was amplified by RT-PCR using A549 cell mRNA as template, the SLC gene fragment was amplified by using pET32a plasmid as template, and the VEGF-SLC fusion gene was amplified by Gene SOEing method, then inserted into the prokaryotic expression plasmid pQE30 to construct the recombinant plasmid pQE30-VEGF-SLC. After restriction endonuclease digestion and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli M15 and identified by IPTG induced target gene expression. Western bolt was used to identify the recombinant plasmid. The target protein was purified by Ni-Agarose His tag protein purification kit. Then the recombinant protein was renatured by decreasing urea concentration gradually. 2. The 96 well plate was coated with recombinant protein with different concentration gradient and negative control. After washing, the recombinant protein was co-cultured with A549 cells and control MRC-5 for 1 hour. The adhesion of recombinant protein VEGF-SLC to the cells was observed by crystal violet staining. Tumor targeting of recombinant protein was evaluated by cell adhesion assay. 3. The recombinant protein with different concentration gradient and negative control were added to the 96 well plate. Each group was divided into 3 multiple holes. After incubated with human peripheral blood lymphocyte suspension for 4 hours, the migration of cells was observed and counted under microscope, and the chemotaxis index was calculated. The chemotactic ability of recombinant protein to peripheral blood lymphocytes was detected by chemotaxis experiment. Results: 1. It was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing that the prokaryotic expression plasmid of pQE30-VEGF-SLC was successfully constructed, and the recombinant VEGF-SLC fusion protein, rVEGE-SLC, was obtained after being transformed into E. coli M15 and expressed by IPTG. By SDS-PAGE analysis, the molecular weight of the fusion protein was about 28K Daa, which mainly existed in the form of inclusion body. The purity of the recombinant protein was over 90% after purification by 6 脳 His tag protein kit. 2. In the cell adhesion assay, A549 cell adhesion was observed in the pore coated with rVEGF-SLC fusion protein. The number of adherent cells increased with the increase of rVEGF-SLC fusion protein concentration. There was no significant cell adhesion between negative control pore and MRC-5 control. 3. In chemotactic experiments, rVEGF-SLC fusion protein can induce the migration of human peripheral blood lymphocytes and reach the maximum chemotaxis index at 3 渭 g / L. Conclusion: 1. The prokaryotic expression plasmid of pQE30-VEGF-SLC was successfully constructed, and the recombinant VEGF-SLC fusion protein could be expressed efficiently in E. coli M15, which laid a foundation for exploring a new way of tumor biotherapy. 2. RVEGF-SLC fusion protein had obvious adhesion to human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro, but had no significant adhesion effect on human embryonic lung fibroblasts MRC-5 cells (non-tumor control cells), which confirmed its tumor targeting; The chemotaxis experiment confirmed that rVEGF-SLC fusion protein had obvious chemotaxis effect on human peripheral blood lymphocytes. Therefore, the recombinant rVEGF-SLC fusion protein has the biological activities of both natural VEGF and SLC. The preparation and study of the tumor targeting fusion protein lay a foundation for exploring the comprehensive approach of targeted therapy and immunotherapy for lung cancer and other tumors.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392-33

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