NF-κB在鼠疫菌毒力蛋白YopE致病过程中作用机制的研究

发布时间：2018-05-21 02:38

  本文选题：鼠疫菌 + YopE　； 参考：《天津大学》2012年硕士论文

【摘要】：YopE是鼠疫菌六种分泌蛋白之一，在鼠疫的致病过程中起重要作用。在宿主细胞内，YopE作为GTP水解酶，通过其144位 精氨酸手指‖结构与细胞膜藕联蛋白RhoGTP酶相互作用使该酶由活性状态转化为非活性状态，导致细胞骨架蛋白actin的降解，使感染细胞受损。如果将其144位的精氨酸突变为丙氨酸（YopE(R144A)）则YopE不具有GAP活性。 核转录因子NF-κB （Nuclear factor-κB）是响应环境变化的一个至关重要的转录因子，是进化上高度保守的信号模块，广泛存在于哺乳动物细胞中。在许多生物过程，如机体的炎症反应、免疫反应、细胞分化与凋亡及其他应激反应等，发挥着至关重要的作用。 本实验室前期通过酵母双杂交筛库及阵列筛选发现YopE与p65存在相互作用，提示YopE与p65的相互作用可能在鼠疫菌的感染过程中起重要的作用。本研究通过免疫共沉淀，，GST-Pull Down实验证明YopE与p65确实存在相互作用。GST-Pull Down实验确定YopE与p65的相互作用结构域为YopE(1-49aa、88-99aa)和p65(201-312aa)，其中YopE的88-99肽段在与p65的相互作用中起重要作用。报告基因实验证明，转染早期YopE以不依赖GAP活性方式显著激活NF-κB通路。间接免疫荧光实验发现YopE能促进p65入核。表达YopE上调NF-κB下游靶基因，其中明显上调NF-κB下游的抗凋亡和炎症反应基因。抑制NF-κB通路增加YopE诱导的细胞凋亡。机制上，我们发现YopE能明显促进p65与IκBα的解离。本文同时还构建了YopE/YopE(R144A)的可诱导表达系统，并用该系统验证了上述实验结果。 此外，本文还采用可诱导表达系统研究了YopE/YopE(R144A)对HeLa细胞生物学特性的影响。发现YopE明显抑制Rosup所引起的细胞ROS产生、阻滞细胞周期、促进p21蛋白表达。 综上，本研究发现YopE通过与p65的相互作用促进NF-κB活化，并提高细胞的存活能力，可能在鼠疫菌早期的感染过程中起到重要的作用。
[Abstract]:YopE is one of the six secretory proteins of Yersinia pestis, which plays an important role in the pathogenesis of Yersinia pestis. In host cells, Yope E was used as a GTP hydrolase. Through the interaction between its 144-arginine finger structure and RhoGTP enzyme of cell membrane, the enzyme changed from active state to inactive state, leading to the degradation of cytoskeletal protein actin. Damage infected cells. If the arginine at position 144 was mutated to Yop EJ R144A), YopE did not have GAP activity. Nuclear factor- 魏 B (NF- 魏 B) is an important transcription factor in response to environmental changes. It is a highly conserved signal module in evolution and widely exists in mammalian cells. In many biological processes, such as inflammation, immune response, cell differentiation and apoptosis, and other stress reactions, play a crucial role. The interaction between YopE and p65 was found by yeast two-hybrid sieve library and array screening in our laboratory, suggesting that the interaction between YopE and p65 may play an important role in the infection of Yersinia pestis. In this study, the interaction between YopE and p65 was confirmed by immunoprecipitation GST-Pull Down assay. GST-Pull Down assay confirmed that the interaction domains of YopE and p65 were YopE ~ (1-49aA) ~ (88-99aa) and p ~ (65) -201-312aaa ~ (a). The 88-99 peptide of YopE played an important role in the interaction with p65. The reporter gene experiment showed that the NF- 魏 B pathway was significantly activated by YopE transfection in a manner independent of GAP activity. Indirect immunofluorescence assay showed that YopE could promote p65 entry. The expression of YopE up-regulated the downstream target gene of NF- 魏 B, including the up-regulation of anti-apoptotic and inflammatory response genes downstream of NF- 魏 B. Inhibition of NF- 魏 B pathway increased apoptosis induced by YopE. In mechanism, we found that YopE can significantly promote the dissociation of p65 and I 魏 B 伪. At the same time, the inducible expression system of YopE / YopEo R144A is constructed, and the experimental results are verified by the system. In addition, the effects of YOPE / YopEr R144A on the biological characteristics of HeLa cells were studied by using inducible expression system. It was found that YopE inhibited the production of ROS induced by Rosup, blocked cell cycle and promoted the expression of p21 protein. In conclusion, we found that YopE may play an important role in the early infection of Yersinia pestis by promoting the activation of NF- 魏 B and enhancing the viability of cells by interacting with p65.
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

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本文编号：1917377