粘膜免疫ClpX蛋白对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制的实验研究

发布时间：2018-05-27 02:39

  本文选题：ClpX + 热休克蛋白　； 参考：《重庆医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S. pn）定植于人类上呼吸道粘膜表面，能引起肺炎、脑膜炎、败血症等一系列疾病，在全球范围内有较高的发病率和病死率。随着抗生素耐药形势的日趋严峻，疫苗在预防肺炎链球菌感染性疾病中的作用愈发重要。 肺炎链球菌ClpX属于HSP100/Clp（酪蛋白水解酶）家族，作为ATP酶亚单位与蛋白酶亚单位ClpP组成ClpXP复合物，有分子伴侣功能，在热应激耐受、底物识别等过程中发挥着重要的作用，与肺炎链球菌的生存、毒力密切相关，同时生物信息学提示该蛋白可能表达于细菌胞外，提示ClpX可能是一个较好的疫苗候选蛋白。因此，本研究旨在探讨ClpX粘膜免疫对肺炎链球菌的保护效果及其机制，评估其作为疫苗候选蛋白的可行性。 方法 利用原核表达技术从大肠埃希菌中表达出S. pn ClpX蛋白（全长），纯化后免疫BALB/c小鼠制备特异性多克隆抗血清。生物信息学预测S. pn中ClpX在细胞内外的表达情况，并利用所制备的anti-ClpX多克隆抗血清，经流式细胞术及Western blot对其进行亚细胞定位分析验证；PCR及Western blot分析ClpX在9种不同血清型肺炎链球菌中的保守性；ELISA测定肺炎链球菌感染患儿、健康儿童以及健康成人血清中ClpX特异性IgG效价；以霍乱毒素(Cholera Toxin, CT)为佐剂，纯化重组ClpX（rClpX）蛋白经鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠，ELISA测定免疫后小鼠血清及唾液中特异性抗体效价及亚型，以及脾细胞经刺激后细胞因子的分泌水平。以S. pn CMCC31693（19F型）进行鼻腔攻毒，于攻毒第5天取小鼠鼻腔灌洗液，计数细菌载量；以S. pn D39（2型）及CMCC31614（14型）分别进行鼻腔攻毒，监测小鼠生存率。 结果 成功构建pET-28(a)-clpX重组质粒，经表达纯化后获得纯度＞90%的重组ClpX蛋白；生物信息学分析预测ClpX可能为分泌型蛋白，，流式细胞术结果表明ClpX不表达于S. pn表面；分离细菌亚组分进行Western blot分析，ClpX在S. pn培养上清中检测出来，提示其为分泌型表达；PCR及Western blot结果显示，9种不同血清型S. pn中ClpX均保守存在；健康儿童血清中ClpX特异性抗体水平高于同年龄组S. pn患儿，且该抗体水平呈现年龄依赖性增长；与对照组相比，纯化rClpX蛋白粘膜免疫小鼠能有效刺激机体血清及唾液中产生高滴度的IgG及IgA水平（P＜0.01），且血清中的IgG以IgG1及IgG2b为主；另外，粘膜免疫rClpX还能有效刺激机体脾细胞产生高水平的IL-17A和IL-4（P＜0.05）；不同血清型S. pn粘膜攻毒结果显示，粘膜免疫rClpX能显著降低19F型S. pn在鼻咽部的定植（P＜0.001），提高2型（P＜0.05）和14型（P＜0.01）S. pn攻毒后小鼠的生存率。 结论 肺炎链球菌ClpX蛋白为分泌型蛋白，在不同血清型S. pn菌株保守性好，在人体中具有免疫原性，满足S. pn疫苗候选蛋白的基本要求。粘膜免疫rClpX能有效刺激机体产生Th2及Th17介导为主的免疫反应，对不同血清型S. pn的鼻咽部定植以及致死性感染有较好的保护效果。因此，ClpX蛋白是一种较好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白。
[Abstract]:Purpose

Streptococcus pneumoniae ( S.pn ) is implanted on the surface of human upper respiratory tract , can cause a series of diseases such as pneumonia , meningitis and septicemia , and has high morbidity and mortality worldwide .

Streptococcus pneumoniae ClpX belongs to the family of HSP100 / Clp ( casein hydrolase ) , which is a ClpXP complex composed of the subunit of ATP enzyme and ClpP of protease subunit . It plays an important role in the process of heat stress tolerance , substrate recognition and so on . It is suggested that ClpX may be a better candidate protein in heat stress tolerance and substrate recognition . Therefore , this study aims to investigate the protective effect and mechanism of ClpX mucosal immunity against Streptococcus pneumoniae , and evaluate its feasibility as vaccine candidate protein .

method

S . pn ClpX protein ( full - length ) was expressed from Escherichia coli by prokaryotic expression technique . The specific polyclonal antiserum was prepared by immunizing BALB / c mice after purification . Bioinformatic prediction was used to predict the expression of ClpX in S . pn .
The conservative properties of ClpX in 9 different serotypes of Streptococcus pneumoniae were analyzed by PCR and Western blot ;
Determination of ClpX - specific IgG titer in children with Streptococcus pneumoniae infection , healthy children and healthy adult serum by ELISA ;
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本文编号：1940093