DEFA1和BECN1相互影响调节大自噬的生理过程

发布时间：2018-05-30 16:00

  本文选题：BECN1 + DEFA1　； 参考：《延边大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：为了观察大自噬和抗菌肽在细胞内的相互作用关系,两者都在生物细胞的抗菌作用中起着关键性的作用。本实验选择了抗菌肽的一个代表DEFAl,通过观察它和大自噬的相关蛋白BECNl之间的相互作用说明DEFA1是如何参与和调节大白噬的过程的。 方法：应用免疫共沉淀、蛋白免疫印迹和共聚焦显微镜等方法,同时采用可以调节大自噬过程的处理方法并在不同的时间窗来观察BECN1和DEFA1蛋白以及大自噬的变化。将BECN1-myc和DEFA1-flag质粒分别以及合并转染给人胚肾293细胞进行免疫共沉淀实验,同时将其转染给人宫颈癌细胞进行荧光染色以及将带有不同荧光质粒的BECN1和DEFA1质粒转染给人宫颈癌细胞制成样本,采用共聚焦显微镜观察其结果以印证免疫共沉淀结果；另外,将转染了BECN1和DEFA1质粒的细胞进行诱导和抑制大自噬的处理在不同时间点观察两个目的蛋白以及大自噬过程的变化。同时为了检测两个蛋白在其他蛋白降解途径中的变化,用蛋白酶抑制剂处理两种蛋白转染后的细胞并检测其变化。其中蛋白免疫印迹实验的结果量化分析后加以统计学分析各个量之间的统计学差异,P0.05表示差异具有显著性。 结果： 1. DEFA1和BECN1在细胞内可互相结合。 2. BECNl和DEFA1都可与溶酶体结合,并使溶酶体向细胞核聚拢；细胞共转染BECN1和DEFA1后溶酶体和DEFA1的结合率明显增高。 3.在饥饿引发的大自噬过程中,BECNl随着饥饿时间的延长没有显著的形态学变化；DEFA1在饥饿2小时时即围成环状位于近核区并维持这个形态持续至饥饿12小时；LC3在未受饥饿处理时是散在状和点状混合存在的,而在饥饿2小时时散在状和点状形态分开,饥饿4到12小时只剩点状形态的LC3。在BECN1和DEFA1共转染的细胞中,BECN1在2小时时出现略微的网状结构；BECN1和LC3共转染的细胞中LC3受BECN1的保护在饥饿4个小时的情况下也没出现显著的形态变化；DEFA1和LC3共转染细胞中LC3在饥饿4小时时受到DEFA1的影响其形态与DEFA1相似。而在BECN1,DEFA1和LC3共转染的细胞中LC3受BECN1和DEFA1影响信号显示非常弱,在饥饿2小时时各个蛋白均呈现散状和点状混合存在,而在饥饿4个小时时形态与LC3和DEFA1共转染4个小时的形态几乎相同,BECN1却没有显著的形态变化。 4.通过免疫印迹实验验证BECN1, DEFA1和LC3(内源)在饥饿2小时和4小时条件下的互相影响,在此过程中DEFA1增强了BECN1的降解,而BECN1却保护了DEFA1不被降解。转染了BECN1, DEFA1和BECN1DEFA1质粒的细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值有所增加。在饥饿诱导大自噬后,除了转染BECN1的细胞其余所有的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值都增加了。 5.巴弗洛霉素保护DEFA1不被降解的作用比对BECN1的强。DEFA1能增强巴弗洛霉素对BECN1降解的保护作用,而BECN1能增强巴弗洛霉素对DEFA1降解的保护作用仅仅是在巴弗洛霉素的浓度为200μM时,在100μM的巴弗洛霉素中DEFA1降解受保护的作用则不被BECN1影响。在巴弗洛霉素和饥饿共同处理的情况下,100μM巴弗洛霉素对BECN1降解的保护作用比对DEFA1的强,当巴弗洛霉素的浓度为200μM时间为6小时时和100μM时相同,而12小时时却相反。 6.溶酶体抑制剂(E64d/Pepstatin A)和饥饿条件共同作用于BECN1和DEFA1时,溶酶体抑制剂在12小时时对BECN1降解的保护作用比对DEFA1的强。DEFA1使溶酶体抑制剂对BECN1降解的保护作用减弱,而BECN1却增强了溶酶体抑制剂对DEFA1的保护作用。 7. BECN1和DEFA1在细胞内的降解都受到蛋白酶抑制剂MG132的保护。 结论：DEFA1引发大自噬的发生,并且可以通过结合自噬的相关蛋白BECN1和LC3参与和调节大自噬的生理过程。除了大自噬的降解途径,BECN1和DEFA1还通过蛋白酶降解途径降解。
[Abstract]:Objective: To observe the interaction between the large autophagy and the antibacterial peptide in the cell, both of them play a key role in the antibacterial action of the biological cells. A representative DEFAl of the antimicrobial peptide was selected in this experiment, and the interaction between it and the related protein BECNl of the large autophagy showed how the DEFA1 was involved and regulated. The process of white ophagy.
Methods: the methods of immunoprecipitation, Western blot and confocal microscopy were used. At the same time, the process of autophagy could be regulated and the changes of BECN1 and DEFA1 protein and autophagy were observed at different time windows. The BECN1-myc and DEFA1-flag plasmids were immunized and transfected to 293 cells of human embryonic kidney, respectively. The co precipitation experiment was used to transfect it to human cervical cancer cells by fluorescence staining and transfection of BECN1 and DEFA1 plasmids with different fluorescent plasmids to human cervical cancer cells. The results were observed by confocal microscopy, and the cells transfected with BECN1 and DEFA1 plasmids were induced to be induced. The treatment of large autophagy was observed at different time points and the changes in the process of autophagy were observed at different time points. In order to detect the changes of the two proteins in other protein degradation pathways, the changes of the transfected cells after the treatment of the two proteins were detected by protease inhibitors. The results of the immunoblot test of the two proteins were quantified. After statistical analysis of the statistical difference between the various quantities, P0.05 indicated that the difference was significant.
Result锛，

本文编号：1955879