内皮细胞向间质细胞转化在纤维化疾病中作用的实验研究
发布时间：2018-06-01 18:32
本文选题：人脐静脉 + 细胞分离 ； 参考：《重庆医科大学》2012年硕士论文
【摘要】：目的：体外建立血管内皮细胞的实验模型 方法：取健康胎儿脐带，采用体外酶消化法分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。倒置相差显微镜下观察细胞形态，免疫荧光法检测细胞中凝血因子Ⅷ的表达，免疫印迹法检测细胞中钙黏蛋白表达。 结果：(1)原代培养细胞形态为圆形、短梭形或扁平形，传代后细胞形态与原代类似，细胞呈铺路石样旺盛生长。(2)原代培养和传代后细胞均表达凝血因子Ⅷ，但传代后细胞凝血因子Ⅷ阳性表达率显著高于原代培养（F值为7.481，P＜0.05）。（3）原代培养和传代后细胞均表达钙黏蛋白。 结论：证实体外分离培养的细胞为HUVEC 目的：观察TNF-α在血管内皮细胞向间质细胞转化中的作用,以探讨纤维化疾病发生的新机制。 方法：取第3~5代对数生长期HUVEC，分别接种于12孔板、6孔板和6cm板中，12孔板和6孔板按随机数字表法分为6组：对照组，培养液不加其他刺激因素，5、10、25、50、100ng/mL TNF-α组，分别在培养液中加相应终浓度TNF-α；6cm板按随机数字表法分为4组：对照组，培养液不加其他刺激因素，5、25、50ng/mL TNF-α组，分别在培养液中加相应终浓度TNF-α。每组3个样本。72h后倒置相差显微镜观察各组细胞形态；免疫荧光法检测12孔板中各组细胞凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；RT-PCR检测6孔板中各组细胞钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA的表达；免疫印迹法检测6cm板中各组细胞钙黏蛋白、α-SMA表达。 结果：（1）对照组细胞形态为圆形、短梭形或扁平型，细胞间连接紧密，5、10、25、50、100ng/mLTNF-α组随着TNF-α浓度的增加，细胞形态逐渐由圆形、短梭形和扁平型向长梭形转变，细胞间连接减少、间隙变大。（2）TNF-α组细胞中凝血因子Ⅷ、α-SMA双阳性细胞数比值均显著高于对照组（F值为45.009，P0.01）。（3）5、10、25、50、100ng/mL TNF-α组细胞中钙黏蛋白mRNA表达水平逐渐降低，后4组细胞中钙黏蛋白mRNA水平显著低于对照组(F值为11.593，P0.05或P㩳0.01)；而α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA表达水平逐渐增高，后3组细胞中α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA表达水平显著高于对照组（F值分别为7.839、2.898，P0.05或P0.01）。(4)5、25、50ng/mLTNF-α组细胞中钙黏蛋白的表达量逐渐降低，后2组水平显著低于对照组（F值为66.551，P㩳0.05或P㩳0.01）；而α-SMA表达量逐渐增加，各组 水平均显著高于对照组（F值为12.335，P㩳0.05或P㩳0.01） 结论: TNF-α呈明显的浓度依赖性地促进血管内皮细胞向间质细胞转化，提示这可能是慢性炎症疾病、瘢痕形成中和纤维化组织内肌成纤维细胞的又一重要来源，促炎症细胞因子是促进这一转化的关键诱因。 目的:观察IL-6在血管内皮细胞向间质细胞转化中的作用,探讨纤维化疾病发生的新机制。 方法：取第3~5代对数生长期HUVEC分别接种于12孔板、6孔板和6cm板中，12孔板和6孔板按随机数字表法均分为6组：对照组，培养液中不加其它刺激因素，5、10、25、50、100ng/mLIL-6组，分别在培养液中加相应终浓度IL-6；6cm板按随机数字表法均分为4组：对照组，培养液中不加其它刺激因素，5、25、50ng/mLIL-6组，分别在培养液中加相应终浓度IL-6。每组3个样本。培养72h后倒置相差显微镜观察各组细胞的形态；免疫荧光法检测12孔板中各组细胞凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；RT-PCR检测6板中各组细胞钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA的表达；免疫印迹法检测6cm板中各组细胞黏蛋白、α-SMA表达。对数据行单因素方差分析及两两比较LSD检验。 结果：（1）对照组细胞呈圆形、短梭形或扁平型，细胞间连接紧密；5、10、25、50、100ng/mLIL-6组细胞随着IL-6浓度的增加，细胞形态逐渐由圆形、短梭形或扁平型向长梭形转变，细胞间连接减少、间隙增宽，细胞胞体变大、呈旋涡样生长。（2）对照组中凝血因子Ⅷ、α-SMA双阳性细胞数比值显著低于各IL-6组（F值为79.72, P0.05或P0.01）。（3）5、10、25、50、100ng/mL IL-6组钙黏蛋白mRNA表达水平逐渐降低，后4组钙黏蛋白mRNA水平显著低于对照组(F值为24.637，，P0.05或P0.01)；α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA表达水平逐渐增高，后4组α-SMAmRNA表达水平显著高于对照组（F值为23.955，P0.05或P0.01），100ng/mL IL-6组Ⅰ型胶原mRNA表达水平显著高于对照组（F值为2.250，P0.05）。(4) IL-6组钙黏蛋白的表达水平逐渐降低，各组表达量显著低于对照组（F值为69.822， P㩳0.01）；而α-SMA表达量逐渐增加，后2组α-SMA表达量显著高于对照组（F值为5.766， P㩳0.01） 结论： IL-6呈浓度依赖性地促进血管内皮细胞向间质细胞转化，提示这可能是慢性炎症疾病和瘢痕形成中纤维化组织内肌成纤维细胞的又一重要来源，表明促炎症细胞因子具有促纤维化效应。
[Abstract]:Objective : To establish an experimental model of vascular endothelial cells in vitro
Methods : Human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) were isolated from healthy fetal umbilical cord and cultured human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) under reversed phase contrast microscope . The expression of coagulation factor 鈪
本文编号：1965208
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