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旋毛虫排泄分泌物调节巨噬细胞及成肌细胞功能的体外研究

发布时间:2018-06-02 09:20

  本文选题:旋毛虫 + 排泄分泌物 ; 参考:《吉林大学》2011年博士论文


【摘要】:旋毛虫是一种寄生于宿主骨骼肌细胞内的胞内寄生线虫,感染所有的哺乳动物(包括人类)和一些食肉鸟类。旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella)引起的一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病。人类旋毛虫病在许多国家爆发,目前在世界范围内约有1100万人被感染,在我国该病仍有发生。旋毛虫感染不同于其他线虫,他的生活史在单一宿主内完成,分成三个主要阶段:成虫、新生幼虫和肌幼虫,其分别寄生于宿主肠上皮细胞和骨骼肌细胞。旋毛虫在感染不同时期,释放许多生物活性物质调节宿主免疫反应并入侵宿主肌细胞为自己构建了一个安全的家(包囊)来达到成功的寄生。 在宿主抵抗外来病原入侵的免疫应答过程中,巨噬细胞在起始,调节,终末效应的各个环节起着重要的作用,因此他被认为是参与机体免疫应答的主要细胞。巨噬细胞在线虫感染中,已作为寄生虫调节宿主免疫反应的靶细胞,对寄生虫生存具有重要意义。另外,巨噬细胞在肌肉损伤的修复过程中也扮演着重要的角色,他不仅可以吞噬凋亡坏死的细胞碎片,而且通过其释放的活性因子调节卫星细胞的激活与分化。目前关于旋毛虫排泄分泌物(即ES)对肌细胞及巨噬细胞功能影响的报道比较少,研究不同时期ES产物对这些细胞功能的影响将有利于我们进一步的阐明旋毛虫免疫逃逸及包囊形成机制。 首先,本研究选择了小鼠巨噬细胞系J774A.1做为细胞模型,调查了旋毛虫不同时期ES产物对巨噬细胞活性的影响。SYBR Green I实时荧光定量PCR和ELISA结果表明,不同时期ES产物降低了LPS刺激的巨噬细胞分泌促炎性细胞因子(IL-1β、IL-12、TNF-α和IL-6)的能力。然而只有旋毛虫3日龄成虫排泄分泌物(AD3 ES)和旋毛虫5日龄成虫(AD5)与新生幼虫(NBL)混合排泄分泌物(AD5-NBL ES)明显抑制了LPS刺激的效应分子iNOS的表达。我们发现:在ES产物单独作用组,旋毛虫不同时期ES产物上调了抗炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)和替代性活化的巨噬细胞标记物Arg1的表达,相反抑制了iNOS的表达,因此我们推测ES产物可能调节巨噬细胞向可替代激活表型转化。另外我们通过细胞免疫荧光和Western blot技术分别检测了NF-κB信号通路中NF-κB的核易位以及MAPKs信号通路的磷酸化情况。结果表明,旋毛虫不同时期ES产物至少部分依靠这两条信号传导通路来抑制促炎性细胞因子的表达。我们推测旋毛虫可以通过抑制促炎性细胞因子的产生和诱导巨噬细胞向可替代激活表型的转换,在巨噬细胞水平调节宿主免疫反应,这将有利于旋毛虫的生存和宿主健康。 其次,本研究将肌幼虫期排泄分泌物(ML ES)体外作用于小鼠C2C12成肌细胞,采用CCK-8、SYBR Green I实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光和Western blot检测ML ES对成肌分化程序的影响。CCK-8分析表明,在低血清条件下,ML ES促进成肌细胞的增殖,同时细胞免疫荧光和Western blot结果表明,在分化条件下,ML ES增强C2C12成肌细胞的细胞增殖核抗原(PCNA)和细胞周期调节因子cyclin D1的表达。另外我们检测了肌细胞终末分化标记物肌球蛋白重链(MHC)的表达,结果显示ML ES作用的成肌细胞MHC的转录及表达明显下降,表明ML ES抑制了C2C12成肌细胞的分化,进一步的细胞免疫荧光实验表明这一抑制效应是可以逆转的。同时,我们调查了抑制机制,结果表明ML ES在转录和转录后水平抑制细胞分化相关因子(MyoD、Myogenin、p21)的表达和p38 MAPK的磷酸化水平。这些结果表明ML ES中存在重要的调节因子能够促使成肌细胞的增殖但抑制它的分化。 最后我们利用共培养技术,建立了巨噬细胞与成肌细胞共培养模型,在体外调查了与旋毛虫ML ES作用后的巨噬细胞共培养对成肌细胞分化的影响。我们的结果表明成肌细胞与ML ES作用后的巨噬细胞共培养上调了成肌细胞PCNA和cyclin D1的表达,说明ML ES作用后的巨噬细胞可以增强成肌细胞的增殖。另外细胞免疫荧光表明,与对照组比较,成肌细胞分化调节因子(MyoD、Myogenin、p21)阳性细胞的数量及终末分化标记物MHC的表达明显降低。我们进一步用Western blot验证了这种抑制效果。本研究表明旋毛虫ML ES不仅可以直接调节成肌细胞的分化,而且可以通过调节巨噬细胞活性来影响成肌细胞的分化,这为研究旋毛虫与宿主细胞及旋毛虫感染后,宿主细胞间相互对话的复杂机制提供了新的思路。
[Abstract]:Trichinosis is a parasitic nematode that is parasitic in the host skeletal muscle cells , infected with all mammals ( including humans ) and some predatory birds . The trichinosis is a worldwide distribution of food - borne human beings with parasitic diseases .

In the course of immune response against foreign pathogen invasion , macrophages play an important role in the initiation , regulation and terminal effect .

The results showed that ES products could regulate the expression of IL - 1尾 , IL - 12 , TNF - 伪 and IL - 6 in macrophages in different periods . The results showed that the ES products could regulate the expression of inflammatory cytokines ( IL - 1尾 , IL - 12 , TNF - 伪 and IL - 6 ) .

The expression of myosin heavy chain ( PCNA ) and cell cycle regulatory factor cyclin D1 in C2C12 myoblasts were detected by means of CCK - 8 , SYBR Green I real - time fluorescence quantitative PCR , immunofluorescence and Western blot analysis .

In the end , we used the co - culture technique to establish the co - culture model of macrophages and myoblasts , and investigated the effect of co - culture of macrophages and macrophages on the differentiation of myoblasts after the action of ML ES . The results showed that the expression of PCNA and cyclin D1 in myoblasts was increased by the co - culture of myoblasts and ML ES .
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

【引证文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 丛立新;李蕾;于录;;金黄色葡萄球菌isdA基因对宿主上皮细胞免疫指标的影响[J];中国人兽共患病学报;2014年04期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 李蕾;金黄色葡萄球菌isdA缺失株的构建及其免疫活性的研究[D];吉林大学;2012年

2 俞昭e,

本文编号:1968246


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