游离脂肪酸及葡萄糖对大鼠主动脉内皮细胞的影响及作用机制
发布时间：2018-06-05 01:20
本文选题：糖尿病 + 游离脂肪酸 ； 参考：《山西医科大学》2012年硕士论文
【摘要】：目的：为研究脂毒性对大血管的损伤作用，，我们利用游离脂肪酸（FreeFattyAcids,FFAs）干预大鼠主动脉内皮细胞（RatAortaEndothelialCell，RAEC），探讨游离脂肪酸对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的影响及作用机制。 方法：原代培养大鼠主动脉内皮细胞（RACE），采用不同浓度的葡萄糖（5.5mmol/L,30mmol/L）及棕榈酸（200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L）单独或联合作用于培养成功的RAEC24h、48h、72h，设立正常对照组和d-BSA对照组。①倒置显微镜下形态学观察；②采用细胞计数法绘制细胞X棾で撸虎勖庖咦橹旧椒谄は赴虎苡τ肕TT比色法检测不同环境下FFAs对RAEC增殖的影响；⑤免疫细胞化学法检测处理前后RAEC中白细胞介素-8(IL-8),B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-celllymphoma2,bcl-2)，Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2AssaciatedXprotein,bax)表达水平。 结果： ①RAEC形态学观察原代细胞在培养5-7天后，在主动脉贴壁附近可见少量游出的内皮细胞；培养到12-13天，可见迁移出的细胞呈片生长，70%—80%单层融合，分布密度不均。培养出的内皮细胞呈梭形、多角形，边界清晰，胞浆丰富，核清晰，铺满后，细胞排列紧密，可见典型的“铺路石”状排列的单层细胞，并有接触抑制现象。培养至7-8代后，细胞变瘦小，分泌物增多，可见细胞分化，成老化状态。 ②细胞生长曲线大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2h后开始贴壁，24h后90%细胞贴壁生长，24h-48h间细胞量有所减少，48h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，传代细胞增殖速率较原代细胞增长稍快，第4-7天为对数生长期，第8-9天为平台期。细胞生长曲线呈“S”型。 ③内皮细胞的鉴定倒置显微镜下可见细胞呈典型的“铺路石”状单层排列贴壁生长，CD31相关抗原鉴定示：细胞呈圆形、梭形或多边形，细胞胞浆内可见棕黄色颗粒，而对照组内未见着色，证实培养的细胞为大鼠主动脉内皮细胞。 ④MTT检测RAEC增殖不同剂量的棕榈酸、葡萄糖及联合培养组处理内皮细胞24h、48h、72h后，与正常培养液组及d-BSA对照组相比差异有统计学意义（P0.05），其中24h低剂量PA组与对照组相比，差异无统计学意义（P0.05）；相同浓度时，24h与72h组内比较，高糖组、高、中、低剂量棕榈酸组差异显著（P0.01），联合培养组不同时间段差异均显著（P0.01）；高糖组、中、高剂量棕榈酸组48h与72h组内比较，24h与48h组内比较差异有统计学意义（P0.05），低剂量组24h与48h，48h与72h组内比较差异无统计学意义（P0.05）。正常培养液组与d-BSA组相比无统计学意义（P0.05）。 ⑤免疫组化法检测结果正常对照组、d-BSA对照组培养内皮细胞48h后，IL-8、BAX几乎不表达或弱表达，两对照组之间无统计学差异（P0.05）。不同浓度FFAs、高糖及联合培养组处理细胞后，细胞IL-8表达明显增高，且具有剂量依赖关系，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P0.05）；细胞bcl-2表达随浓度的增高表达逐渐减弱，与正常对照组及d-BSA对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）；而细胞BAX表达则随浓度的增加表达亦增强，与正常对照组及d-BSA组比较，差异有统计学意义（P0.05）。Bcl-2/bax比值随葡萄糖及棕榈酸浓度增高逐渐减低，联合培养组为甚。 结论：体外培养并获得7代内皮细胞，形态学观察及CD31相关抗原鉴定证实本实验成功的培养原代及传代生长的内皮细胞；本培养方法操作简便，周期较短，价格低廉，内皮细胞纯度较高，适宜实验所需。高浓度FFAs及高糖具有抑制内皮细胞生长，促进其凋亡的作用，并且具有时间浓度依赖性。这种作用机制可能是通过葡萄糖及棕榈酸酯参与PI3K/AKT等途径激活氧化应激诱导细胞凋亡。同时炎性因子IL-8表达增加，参与并共同促进主动脉内皮细胞凋亡的发生。
[Abstract]:Objective: To study the effect of lipid toxicity on large blood vessels, we used FreeFattyAcids (FFAs) to intervene in rat aortic endothelial cells (RatAortaEndothelialCell, RAEC) and explore the effect and mechanism of free fatty acid on the proliferation and apoptosis of rat aortic endothelial cells.
Methods: primary cultured rat aortic endothelial cells (RACE) were cultured with different concentrations of glucose (5.5mmol/L, 30mmol/L) and palmitic acid (200 mu mol/L, 400 mu mol/L, 600 micron mol/L) individually or jointly on the successful culture of RAEC24h, 48h, 72h, set up normal control group and d-BSA control group. The effect of FFAs on the proliferation of RAEC in different environments was detected by the method of TT colorimetric assay in different environments; (5) the FFAs, IL-8, B cell lymphoma / leukemia -2 protein (B-celllymphoma2, bcl-2), Bcl-2 related protein SaciatedXprotein, Bax) expression level.
Result锛
本文编号：1979753
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