硫化氢对人脐静脉内皮细胞衰老的影响及机制的初步研究

发布时间：2018-06-05 04:03

  本文选题：硫化氢 + 人脐静脉内皮细胞　； 参考：《南华大学》2012年硕士论文

【摘要】：背景与目的： 随着年龄的增加，机体各组织器官功能出现退行性改变，导致各种老年性疾病的发生。衰老已被认为是心血管疾病发生的一个重要的危险因素。内皮是最容易受衰老影响的组织之一，内皮细胞衰老是内皮衰老的基础。研究内皮细胞衰老机制并探索减缓内皮细胞衰老的新方法，对心血管疾病的防治具有重要意义。自由基学说认为氧化应激损伤是导致细胞衰老的主要原因之一。本研究采用过氧化氢（hydrogen peroxide，H_2O_2）诱导建立人脐静脉内皮细胞（human umbilicalvascular endothelial cells，HUVECs）衰老模型，旨在探讨硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）对HUVECs衰老的影响及其机制。 方法与结果： 1.采用酶消化法分离HUVECs，并进行原代培养，选取第二代稳定生长的细胞，倒置显微镜下观察，细胞呈短梭形，边界清晰，细胞经体外培养7天后，细胞融合呈现典型的铺路石样排列。采用免疫组织化学法检测HUVECs特异性标记物Ⅷ因子的表达以鉴定HUVECs及其纯度。 2.采用25μmol/L H_2O_2诱导HUVECs建立细胞衰老模型，应用相差光镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，衰老相关β-半乳糖苷酶（senescenceassociated acidic-β-galactosidase， SA-β-gal）染色检测衰老细胞率，蛋白免疫印迹（Western Blot）检测细胞周期调控因子p21的表达，，从而鉴定HUVECs的衰老程度。结果表明，H_2O_2处理后，细胞体积增大，细胞边界不清，大小不均，呈衰老细胞样形态；SA-β-gal阳性细胞数达到11.2±1.06%（P0.05）；G0/G1期细胞比例增加25%；细胞周期蛋白p21的表达也明显上调，为正常细胞的1.5倍，且差异具有统计学意义（P0.05）。 3.选择不同浓度NaHS（0、15、30、60μmol/L）预先处理HUVECs48h后，再用H_2O_2诱导HUVECs衰老，采用SA-β-gal染色，流式细胞术检测细胞周期变化，MTT法检测细胞增殖率，划痕实验检测细胞迁移率，分析H2S对H_2O_2诱导的HUVECs衰老的影响。结果显示，与H_2O_2单独处理组比较，NaHS组SA-β-gal染色阳性细胞数随浓度的增高而减少（P0.05），且NaHS浓度为60μmol/L时阳性细胞数最少(P0.01)；G0/G1期细胞比例降低16%，S期细胞比例增加14%（P0.05）；HUVECs的增殖迁移功能增加。 4.采用Western Blot及Sirt1活性检测试剂盒测定H2S抗H_2O_2诱导HUVECs衰老中Sirt1蛋白表达及其活性，分析H2S对Sirt1的调节机制，结果表明，与H_2O_2相比，NaHS组Sirt1蛋白的表达没有明显改变，Sirt1的活性上调了19.21%。 5.采用沉默信息调节因子1（silent information regulator1， Sirt1）抑制剂NAM与NaHS共同孵育HUVECs48h，再应用H_2O_2诱导HUVECs衰老，观察HUVECs SA-β-gal染色阳性细胞数的改变以及HUVECs增殖、迁移能力的变化，分析Sirt1被抑制后， H2S抗H_2O_2诱导HUVECs衰老的作用是否发生变化。结果显示，与NaHS组相比较，NAM+NaHS组SA-β-gal染色阳性细胞数增加了50%，并且HUVECs增殖，迁移功能明显降低。 结论： H2S可拮抗H_2O_2诱导的HUVECs的衰老，其作用机制与上调Sirt1的活性有关。
[Abstract]:Background and purpose: With the increase of age, degenerative changes in the function of various tissues and organs of the body result in the occurrence of various senile diseases. Aging has been recognized as an important risk factor for cardiovascular disease. Endothelium is one of the most susceptible tissues, and endothelial cell senescence is the basis of endothelial senescence. It is of great significance to study the mechanism of endothelial cell senescence and to explore a new method to slow down the aging of endothelial cells for the prevention and treatment of cardiovascular disease. Free radical theory suggests that oxidative stress injury is one of the main causes of cell senescence. In this study, the aging model of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was established by H _ 2O _ 2 (H _ 2O _ 2). The purpose of this study was to investigate the effect of hydrogen sulfide H _ 2S) on HUVECs senescence and its mechanism. Methods and results: 1. HUVECs were isolated by enzyme digestion and cultured in primary culture. The cells of the second generation of stable growth were selected. The cells were observed under inverted microscope. The cells were spindle-shaped, and the boundary was clear. The cells were cultured in vitro for 7 days. Cell fusion presents a typical paving stone arrangement. The expression of HUVECs specific marker factor 鈪

本文编号：1980411