转录辅助抑制因子Grg3参与干细胞多能性基因OCT4转录调控机理初探

发布时间：2018-06-06 10:18

  本文选题：P19EC + 细胞　； 参考：《湖南大学》2012年硕士论文

【摘要】：干细胞（Stem cell，SC）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。近年来干细胞领域的研究为疾病治疗提供了崭新思路，极大的推动了基础医学研究的发展。干细胞多能性维持与定向分化过程涉及特定基因表达的开启与关闭，依赖于复杂而精细的转录调控网络。本文以P19EC细胞为体系，对干细胞多能性关键基因OCT4在干细胞分化早期的抑制表达机理作了初步探索。 转录辅助抑制因子Grg3（Groucho-related gene3）属于Groucho辅助抑制因子（corepressor）家族，在胚胎发育及器官形成等生理过程中发挥重要作用。以往的研究表明，由于蛋白序列中不具备DNA结合域，转录辅助抑制因子Grg3通常被能结合DNA的转录因子招募至靶基因的调控区域，进而可能通过改变染色质修饰状态以实现转录抑制功能。本文中使用多种手段考察了Grg3参与多能性基因OCT4转录抑制的机制。Grg3表达水平在P19细胞受维甲酸诱导向神经分化的过程中维持不变，，通过运用Grg3特异性siRNA以及外源Grg3-V5融合蛋白高表达质粒工具，我们发现P19EC细胞中OCT4表达水平受到Grg3蛋白水平变化的调节，高水平的Grg3抑制OCT4表达，干扰Grg3则使OCT4表达水平上升。进一步的双荧光素酶报告基因实验以及CHIP实验证实Grg3对OCT4的表达抑制是通过特异性结合在OCT4启动子－3500bp~－3345bp区域来实现的。 转录因子FoxA1（Forkhead box A1）也叫HNF3α，属于叉头蛋白家族（Forkheadfamily）并参与调节众多生理过程。研究表明FoxA1是P19向神经分化早期的关键因子，且在体外已被证明与Grg3存在蛋白-蛋白相互作用，本文中也通过免疫荧光共定位实验在胞内证实了这一点。OCT4启动子－3500bp~－3345bp区域包含2个FoxA1结合位点，双荧光素酶报告基因实验结果表明，这2个位点的点突变将使Grg3对该启动子区域活性的抑制作用消失。因此，FoxA1可能是OCT4转录抑制中招募Grg3的关键因子。
[Abstract]:Stem cell sci (stem cell sci) is a group of cells with self-renewal and multi-differentiation potential. In recent years, stem cell research has provided new ideas for disease treatment and greatly promoted the development of basic medicine. Pluripotent maintenance and directional differentiation of stem cells involve the opening and closing of specific gene expression and rely on complex and delicate transcriptional regulatory networks. In this paper, the mechanism of inhibition and expression of OCT4, a key gene for pluripotency of stem cells, was studied in P19EC cells at the early stage of stem cell differentiation. Grg3 cocho-related gene belongs to the Groucho corepressor-family. Play an important role in embryonic development and organ formation and other physiological processes. Previous studies have shown that due to the absence of DNA binding domains in protein sequences, transcription co-suppressor Grg3 is usually recruited to target gene regulatory regions by transcription factors that bind to DNA. In turn, transcriptional inhibition may be achieved by changing the chromatin modification state. In this study, we investigated the mechanism of Grg3 involved in the transcription inhibition of multipotent gene OCT4. The expression level of Grg3 remained unchanged in the process of P19 cell differentiation induced by retinoic acid. By using Grg3 specific siRNA and high expression plasmid tools of exogenous Grg3-V5 fusion protein, we found that the expression of OCT4 in P19EC cells was regulated by the change of Grg3 protein level. High level of Grg3 inhibited OCT4 expression, and interference of Grg3 increased OCT4 expression. The further double luciferase reporter gene experiment and chip experiment confirmed that the inhibition of OCT4 expression by Grg3 was achieved by specifically binding in the region of OCT4 promoter -3500bpn-3345bp. The transcription factor FoxA1 (Forkhead box A1), also called HNF3 伪, belongs to Forkheadyfamilyfamily family). And involved in the regulation of many physiological processes. It has been shown that FoxA1 is a key factor in the early stage of P19 neural differentiation and has been proved to have protein-protein interaction with Grg3 in vitro. It was also confirmed by immunofluorescence co-localization assay that the region of .OCT4 promoter -3500bpf-3345bp contained two FoxA1 binding sites. The results of double luciferase reporter gene experiment showed that the OCT4 promoter contained two FoxA1 binding sites. The point mutation of these two loci will make Grg3 lose its inhibitory effect on the activity of the promoter region. Therefore, FoxA1 may be a key factor in recruitment of Grg3 in OCT4 transcription inhibition.
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R341

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