甲型H1N1（2009）流感病毒HA的原核表达、抗体制备及初步应用

发布时间：2018-06-06 15:47

  本文选题：甲型H1N1(2009)流感病毒 + 血凝素　； 参考：《河南工业大学》2011年硕士论文

【摘要】：甲型H1N1(2009)流感病毒基因组包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段，是多种病毒基因自然重组后形成的一种新型流感病毒。病毒的基因组是单链负义RNA，由8个节段组成，编码10种蛋白质。其中血凝素(hemagglutinin,HA)是由第四节段编码的表面糖蛋白，是流感病毒的主要保护性抗原，能够刺激机体产生特异性中和抗体。因此，HA是基因工程疫苗的首选抗原，，也是流感病毒检测的主要抗原，对流感病毒血凝素的研究有助于流感的预防控制及疫苗和诊断试剂的进一步研究。 本研究利用甲型H1N1(2009)的HA（GenBank:GQ122097.1）全长基因序列，通过抗原表位分析、密码子优化、去除两端疏水氨基酸序列来优化基因序列，合成目的基因。将目的基因连接到表达载体pET-30Xa/LIC，转化大肠杆菌BL21（DE3），酶切和测序鉴定。经IPTG诱导和SDS-PAGE分析HA融合蛋白得到了成功表达，最佳诱导条件为：温度37℃、IPTG终浓度为0.05mmol/L、诱导时间6h。融合蛋白主要以包涵体的形式存在，分子量为63kD，Western-blot鉴定表明其有良好反应原性，通过镍离子亲和纯化并复性后获得了纯度达到90%以上的重组蛋白。 用复性蛋白免疫6～8周BALB/c小鼠，将免疫脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，通过有限稀释法筛选，获得3株能够稳定分泌HA抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为HA-B8、HA-D1、HA-H2。制备腹水，经纯化鉴定，此三种单克隆抗体的免疫球蛋白均为IgG1，效价达到105，交叉反应试验表明具有良好的特异性。 用复性蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗HA多克隆抗体，经琼脂扩散实验检测效价达到1：32。将制备的多克隆抗体经硫酸铵沉淀和亲和层析纯化，得到了较高纯度抗体，经检测具有良好的特异性。用辣根过氧化物酶（HRP）标记，制备酶标抗体。 用纯化单克隆抗体作为包被抗体，用标记多克隆抗体作为酶标抗体，初步建立检测甲型H1N1(2009)流感病毒的双抗体夹心ELISA，实验表明该检测方法对H5N1、H9N2亚型流感病毒及EV71病毒、麻疹病毒无交叉反应，具有良好的特异性。 本研究在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了HA蛋白，以重组蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔分别制备单克隆抗体和多克隆抗体，并以此为基础初步建立了甲型H1N1(2009)流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。
[Abstract]:The genome of influenza virus contains human influenza virus, avian influenza virus and swine flu virus. It is a new type of influenza virus formed by natural recombination of genes of many kinds of viruses. The genome of the virus is a single-stranded negative RNAs consisting of 8 segments that encode 10 proteins. Hemagglutinin (HA), a surface glycoprotein encoded by the fourth segment, is the main protective antigen of influenza virus and can stimulate the production of specific neutralizing antibodies. Therefore, HA is the first antigen of genetic engineering vaccine, and it is also the main antigen of influenza virus detection. The study of hemagglutinin of influenza virus is helpful to the prevention and control of influenza and the further study of vaccine and diagnostic reagent. In this study, the full-length gene sequence of HAH GenBank: GQ122097.1) was used to optimize the codon by epitope analysis. The hydrophobic amino acid sequence is removed to optimize the gene sequence and synthesize the target gene. The target gene was ligated into the expression vector pET-30Xa / L IC. the target gene was transformed into E. coli BL21DDE3, digested and sequenced. The HA fusion protein was successfully expressed by IPTG induction and SDS-PAGE analysis. The optimal induction conditions were as follows: the final concentration of IPTG was 0.05 mmol / L at 37 鈩

本文编号：1987239