20S蛋白酶体参与调控神经干细胞衰老进程

发布时间：2018-06-13 15:20

  本文选题：神经干细胞 + 衰老　； 参考：《山西医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：采用在体和离体研究的技术手段，观察不同年龄阶段小鼠神经干细胞(NeuralStemCells,NSCs)衰老标志物及其增殖潜能的变化，揭示NSCs衰老进程。并在此研究基础上深入探讨20S蛋白酶体及其核心亚单位PSMB1和PSMB5在NSCs衰老进程中的调控作用，明确20S蛋白酶体活性改变对NSCs增殖能力的影响，揭示NSCs衰老机理，以期为恢复干细胞活力提供新思路。 方法：选取胚胎（Embryonicdays14,E14）、新生（Postnatalday0，P0）、成年（Postnataldays90，P90）、老年（Postnataldays540，P540）小鼠作为研究对象。1.采用SA-β-gal（senescence-associatedβ-galactosidase）染色法观察不同年龄小鼠脑内衰老细胞数量，判定脑老化程度；同时腹腔注射BrdU，通过BrdU标记实验检测不同年龄小鼠室管膜下区（Subventricularzone,SVZ）NSCs增殖潜能。2.体外分离培养源自不同年龄小鼠NSCs，采用BrdU掺入实验和SA-β-gal染色法，通过离体实验进一步观察不同年龄NSCs增殖能力及衰老标志物的表达变化。3.应用20S/nestin免疫荧光双标，检测20S蛋白酶体在NSCs的表达。4.应用荧光分光光度法检测源自不同年龄阶段NSCs20S蛋白酶体活性。5.提取源自不同年龄小鼠NSCs总RNA，采用SYBRGreenReal-timePCR方法在基因水平定量分析20S蛋白酶体核心亚单位PSMB1和PSMB5的表达变化。6.应用蛋白酶体抑制剂MG132作用于体外培养NSCs，通过BrdU掺入实验和CCK-8法检测不同浓度MG132对NSCs增殖潜能的影响。 结果：1.SA-β-gal染色结果显示，P90和P540小鼠SVZ脑区周围可见大量胞浆呈蓝色着色的SA-β-gal阳性衰老细胞，而E14和P0小鼠SVZ脑区周围仅偶见个别SA-β-gal阳性衰老细胞，提示随年龄增加脑内SA-β-gal活性增强，衰老细胞逐渐增多。伴随SA-β-gal活性上调，P90和P540小鼠SVZBrdU+细胞急剧减少，分别较E14小鼠减少92%和95%，BrdU+细胞散在分布于P90和P540小鼠侧脑室背外侧角和外侧壁，表明成年期和老年期NSCs增殖潜能降低。2.体外分离培养源自不同年龄小鼠NSCs，P90和P540小鼠神经球形成周期较E14和P0延长，BrdU阳性率分别为4.1%±0.4%和8.4%±0.9%（p0.01），较E14（38.0%±2.0%，p0.01）和P0（20.8%±1.24%，p0.01）显著降低；SA-β-gal染色结果显示P90与P540阳性衰老细胞明显增多，SA-β-gal阳性率分别为26.0%±0.8%和27.6%±1.2%（p0.01），此体外研究结果进一步表明成年期后NSCs增殖能力降低，NSCs出现老化现象。3.20S/nestin免疫荧光染色结果显示NSCs表达20S蛋白酶体，20S蛋白酶体分布于NSCs细胞浆和细胞核。4.荧光分光光度法检测源自不同年龄阶段小鼠NSCs20S蛋白酶体活性，结果显示P90组NSCs20S蛋白酶体活性为E14组0.8±0.2倍（p0.01），P540组NSCs20S蛋白酶体活性为E14组0.6±0.1倍（p0.001），提示成年期及老年期NSCs20S蛋白酶体活性下调。5.Real-timePCR定量分析不同年龄阶段NSCs20S蛋白酶体核心亚单位PSMB1和PSMB5mRNA表达变化，其中P90组PSMB1mRNA表达水平为E14组35%±1%（p0.001），PSMB5mRNA表达水平为E14组41%±1%（p0.001）；P540组PSMB1mRNA表达水平为E14组34%±8%（p0.001），PSMB5mRNA表达水平为E14组66%±1%（p0.001），，提示成年期和老年期20S蛋白酶体核心亚单位PSMB1和PSMB5mRNA表达水平下调。6.应用蛋白酶体抑制剂MG132作用于体外培养NSCs5h，BrdU掺入实验结果显示0.8μMMG132能够显著抑制NSCs增殖能力，其BrdU阳性率较DMSO溶剂对照组减少22.7%（p0.05），并且此抑制作用呈现剂量依赖性；CCK-8检测结果进一步表明随MG132浓度增加NSCs细胞活力逐步降低，20μMMG132能够使NSCs增殖能力降低44%（p0.05），提示蛋白酶体活性下调可能是导致NSCs衰老进程中细胞增殖潜能降低的重要因素。 结论：1.随年龄增加NSCs增殖潜能降低，衰老标志物表达水平上调，NSCs出现老化现象。 2成年和老年NSCs，20S蛋白酶体活性及其核心亚单位PMSB1和PMSB5mRNA表达水平下降，提示蛋白酶体与NSCs衰老进程密切相关。 3.抑制蛋白酶体活性能够显著降低NSCs增殖能力，提示蛋白酶体参与NSCs功能维持
[Abstract]:Objective : To observe the changes of the aging marker and its proliferative potential in mouse neural stem cells in different age groups by means of the technique of somatic and ex vivo studies , to reveal the aging process .

Methods : Embryonic ( E14 ) , neonatal ( Postnatalday0 , P0 ) , adult ( Postnataldays90 , P90 ) and old age ( Postnataldays540 , P540 ) mice were studied .
5 . The effect of the inhibitor MG132 on the proliferation and the proliferation potential in vitro was detected by the use of the SYBR GreenReal - time PCR method in vitro .

Results : 1 . The results of SA - 尾 - gal staining showed that there was a large amount of blue - colored SA - 尾 - gal positive senescent cells around the SVZ brain area of P90 and P540 mice , while those of E14 and P540 mice were significantly decreased compared with those of E14 and P540 mice .
The results of SA - 尾 - gal staining showed that P90 and P540 positive aging cells were significantly increased , the positive rates of SA - 尾 - gal were 26 . 0 % 卤 0 . 8 % and 27 . 6 % 卤 1.2 % ( p < 0 . 01 ) .
In the P540 group , the expression level was 34 % 卤 8 % ( p0.001 ) in E14 group and 66 % 卤 1 % in E14 group ( p < 0.001 ) . The expression level of PSM B5mRNA was lower than that in E14 group .
The results of CCK - 8 assay further showed that the cell viability was decreased gradually with the concentration of MG132 , and 20 渭MMG132 could decrease the proliferation ability by 44 % ( p < 0.05 ) . It was suggested that the down regulation of proteasome activity could be an important factor in the decrease of cell proliferation potential in the course of aging .

Conclusion : 1 . With the increase of age , the proliferative potential is decreased , and the expression level of aging marker is up - regulated .

2 . The expression levels of PM1 and PMSB5 mRNA in adult and old - aged and old - aged cells were decreased , suggesting that the proteasome is closely related to the aging process .

3 . Inhibition of proteasome activity can significantly reduce the proliferation ability of neural stem cells , and suggest that the proteasome is involved in the functional maintenance of neural stem cells .
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：2014464