致病性大肠杆菌IntiminC280、BfpA和EspA原核表达载体的构建及蛋白的表达与纯化

发布时间：2018-06-18 02:09

  本文选题：EPEC + IntiminC280　； 参考：《川北医学院》2012年硕士论文

【摘要】：背景： 致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）是引起发展中国家婴幼儿腹泻的重要病原体。EPEC致病标志性的特点之一就是产生粘附脱落损伤（AE）。所有与AE损伤有关的基因片段均由染色体上一段长为35 kb的被称为上皮细胞脱落基因座（LEE）的毒力岛编码。EPEC与宿主细胞最初的粘附是由EspA介导的,通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）的效应分子易位到宿主细胞。紧密粘附由外膜蛋白紧密素intimin介导。IV型束状菌毛（BFP）与微小菌落的形成有关，可以促进细菌之间的相互作用，在志愿者参与的实验中被证实是EPEC的毒力因子之一。目前国内外有关EPEC的疫苗研究较少。本研究旨在通过基因重组的方法表达与EPEC毒力有关的三个致病因子的蛋白，通过亲和层析的方法纯化，为EPEC疫苗的研究奠定基础。 目的： （1）分别构建致病性大肠杆菌intiminC280、bfpA和espA原核表达载体pQE30-intiminC280，pQE30-bfpA和pQE30-espA。 （2）观察重组质粒pQE30-intiminC280，pQE30-bfpA和pQE30-espA在M15中的蛋白表达情况； （3）检测IntiminC280、BfpA和EspA蛋白的表达形式 （4）初步纯化所表达的蛋白 方法： （1）分别设计三对引物，，用PCR方法扩增EPEC O127:H6的三个致病基因intiminC280、bfpA和espA，测定序列的正确性。 （2）将扩增的三个目的基因片段通过基因重组到原核表达载体pQE30中,并转化至M15中。 （3）用IPTG诱导含有重组质粒的M15使其表达相应蛋白。 （4）SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白的存在形式 （5）用亲和层析的方法初步纯化以包涵体形式存在的蛋白。 结果： （1）成功构建致病性大肠杆菌pQE30/intiminC280、pQE30/bfpA和pQE30/espA原核表达载体 （2）成功表达IntiminC280和EspA，但BfpA未见表达； （3）IntiminC280和EspA的蛋白表达形式有包涵体和可溶性表达； （4）成功纯化了IntiminC280和EspA以包涵体形式表达的蛋白。 结论： （1）IntiminC280和EspA属于外膜蛋白，易于建立原核表达系统。 （2）BfpA属于跨膜蛋白，重组质粒易于构建，但表达的条件仍有待进一步研究。 （3）用亲和层析的方法可纯化含有组氨酸标签的重组IntiminC280和EspA蛋白。
[Abstract]:Background: pathogenic E. coli enterogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the most important pathogens of infantile diarrhea in developing countries. All the gene fragments associated with AE damage were encoded by a virulence island of 35 kb on the chromosome called epithelial cell exfoliative gene locus (LEE). The initial adhesion of EPEC to host cells was mediated by EspA. The effector molecules of type 鈪

本文编号：2033533