低氧对L02细胞脂肪代谢的影响及其可能机制

发布时间：2018-06-18 20:19

  本文选题：低氧诱导因子-2α + 脂肪分化相关蛋白　； 参考：《重庆医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：研究背景与目的 随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholicfatty liver disease, NAFLD）发病率逐渐升高，已经严重影响人们的生活质量。肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗/2型糖尿病等均为NAFLD明确的易患因素。然而，近年来有文献报道，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)患者常伴有明显肝损伤，认为与呼吸暂停所致低氧诱导的肝脏脂肪变性有关[1-2]。目前，有关低氧情况下肝脏脂代谢异常的机制仍不十分清楚，报道甚少。本研究拟通过低氧培养人正常肝细胞株L02细胞，观察肝细胞脂代谢相关固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)及低氧相关低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)2α、脂肪分化相关蛋白（adiposedifferentiation-related protein,ADFP）的表达变化，探讨低氧对肝细胞脂代谢的影响及其可能机制，可能为NAFLD提供新的治疗靶点。 方法 1、细胞培养：用RPMI1640培养液（含10％胎牛血清、0.0625g/L青霉素、0.1g/L链霉素）培养肝L02细胞。 2、实验分组：结合文献[3]，实验分对照组（21%O_2常氧培养）、低氧组（1%O_2低氧培养）。 3、低氧模型的建立：MTT比色法检测1%低氧对L02细胞生长的影响，确定低氧培养时间点。 4、通过L02细胞内TG测定和油红O染色了解其脂变情况； RT-PCR法检测HIF-2α、SREBP-1mRNA的表达；Western Blot法检测SREBP-1、FAS、HIF-2α、ADFP的蛋白表达。 结果 1、成功建立低氧诱导的肝L02细胞脂肪变性模型。随着低氧暴露时间的不断延长，肝细胞脂肪变程度逐渐加重。 1）低氧模型的建立：将细胞放入温度为37℃含有1%O_2、5％CO_2、94%N2饱和湿度的三气培养箱中分别培养12、24、48h。 2）TG测定：与对照组相应时间点比较，低氧处理各时间点TG含量均增加，其中12h点，两组差异无统计学意义（P0.05），，24、48h两个时间点，差异有统计学意义（P0.01）；且低氧处理时间越长，TG含量越多（F=115.04，P0.01）。 3）油红O染色：对照组仅见胞质内少量橘红色脂滴，而各低氧处理组随着低氧培养时间延长，细胞内脂滴数量增多，且出现脂滴融合现象。 2、各组细胞内SREBP-1、FAS的表达情况。 低氧12、24、48h各时间点SREBP-1mRNA和蛋白、FAS蛋白表达均较对照组下调（P值均0.01）。 3、各组细胞内HIF-2α、ADFP的表达变化。 各时间点细胞内均可检测到HIF-2αmRNA的表达，但差异无统计学意义。常氧组细胞中未检测到HIF-2α蛋白表达，低氧处理3h后HIF-2α蛋白表达逐渐增加，6h后达高峰，12、24h又逐渐降低（F=85.30,P0.01）；与对照组比较，低氧12、24、48h各时间点ADFP蛋白表达均明显上调（P值均0.05），且随低氧时间延长，表达量逐渐增多（F=167.49，P0.05）。 结论 1、SREBP-1-FAS生脂途径可能没有参与低氧介导的肝细胞脂变。 2、HIF-2-ADFP是介导低氧诱导肝细胞脂质沉积的重要机制。 3、HIF-2α有可能成为脂肪肝治疗的新靶点。
[Abstract]:Background and purpose of study

In recent years , it has been reported that the mechanism of lipid metabolism related sterol regulatory element binding protein , fatty acid synthase ( FAS ) and hypoxia - related hypoxia - inducible factor ( ADFP ) in patients with obstructive sleep apnea syndrome ( Obstructive sleep apnea syndrome ) have been reported in recent years . The effects of hypoxia on lipid metabolism in liver cells and possible mechanism of hypoxia - related hypoxia - inducible factor ( ADFP ) may be observed .

method

1 . Cell culture : The liver L02 cells were cultured with RPMI1640 medium ( containing 10 % fetal bovine serum , 0.0625 g / L penicillin , 0.1 g / L streptomycin ) .

2 . Experimental group : The experiment group was divided into control group ( 21 % O _ 2 normal oxygen culture ) and hypoxia group ( 1 % O _ 2 hypoxia culture ) .

3 . The hypoxia model was established : MTT colorimetric assay was used to detect the effect of 1 % hypoxia on the growth of L02 cells and to determine the time point of hypoxia culture .

4 . L02 intracellular TG assay and oil red O staining were used to investigate the lipid change .
RT - PCR assay was used to detect the expression of HIF - 2伪and BIR - 1mRNA .
Western Blot was used to detect the expression of protein , FAS , HIF - 2伪and ADFP .

Results

1 . The fat degeneration model of L02 cells induced by hypoxia was successfully established . With the increasing of hypoxia exposure time , the degree of fatty degeneration of hepatocytes was gradually increased .

1 ) Establishment of hypoxic model : The cells were cultured in a three - gas incubator containing 1 % O2 , 5 % CO _ 2 , 94 % N2 saturated humidity at 37 鈩

本文编号：2036742