刀豆凝集素纯化及其寡糖链结构初步分析

发布时间：2018-06-25 12:28

  本文选题：刀豆 + 凝集素　； 参考：《西北大学》2012年硕士论文

【摘要】：凝集素(lectin)是一种非抗体类的蛋白质或糖蛋白,它能与糖类专一地非共价结合,并具有凝集细胞和沉淀聚糖和复合糖的作用。凝集素在生物界广泛分布,存在于动物,植物以及微生物中。在各种凝集素中,刀豆凝集素(Concanavalin A, ConA)应用最为广泛。本文以刀豆(Canavalia gladiata (Jacq.) DC)干种籽粒为原材料,优化刀豆凝集素提取、纯化工艺,并对其寡糖链结构进行了初步探究,主要包含以下几部分： 1.刀豆凝集素的分离、纯化以及分提取工艺优化 500g刀豆种子首先粉碎后过60目筛子,然后利用低沸点(30～60℃)石油醚脱脂后得到410g脱脂干粉,用pH7.4,0.01mol/L的PBS缓冲液提取水溶性蛋白质。采用盐析(硫酸铵分级沉淀)法得到水溶性刀刀豆凝集素粗品10.6g,得率为2.12%。粗品刀豆凝集素再经过DEAE-纤维素柱和SephadexG-100亲和层析柱纯化得到刀豆凝集素1.6g,最终得率为0.32%。 刀豆凝集素对热稳定,通过对不同温度下提取得到凝集素的血凝活力进行比较,发现纯化过程在室温下完成,也可以获得比较理想的效果。传统纯化工艺中比较繁琐,应用于微量分析时比较费时。因此本文采用了优化的纯化工艺：刀豆凝集素溶解在PBS缓冲液后,直接进行SephadexG-100亲和层析柱纯化,缩短了提取周期,提高了纯化效率。 2.理化性质的研究 通过HPLC、GC, GC-MS、IR、紫外分光光度计等仪器对刀豆凝集素的理化性质进行了研究(表1)。刀豆凝集素是一种重要的糖蛋白,研究发现：刀豆凝集素的亚基相对分子量为3.14×104,刀豆凝集素的蛋白含量为93.75%,糖含量为7.28%。在非还原性条件下经过碱水解后,刀豆凝集素中特定氨基酸(形成糖肽键的Ser与Thr)转化为α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸,根据紫外光图谱分析得知刀豆凝集素上的寡糖链与蛋白链接方式为O-连接。刀豆凝集素中寡糖链是通过Ser或Thr形成O-糖苷键与蛋白部分连接。 3.刀豆凝集素糖链的结构研究 刀豆凝集素经Pronase E酶解后得到其寡糖链,经过微晶纤维素除去蛋白质和Dowex50(H+)阳离子交换树脂除去盐分,再通过甲基化分析、部分酸水解,结合气相色谱质谱联用等结果分析发现刀豆凝集素寡糖链中Ara残基之间的连接方式是1-3连接。纯化后的寡糖链经过ESI-MS分析,推测刀豆凝集素寡糖链结构可能为寡聚Ara如下图所示：
[Abstract]:Lectin (lectin) is a kind of non-antibody protein or glycoprotein, which can bind to carbohydrate specifically and has the functions of agglutination cells, precipitated polysaccharides and complex sugar. Lectin is widely distributed in animals, plants and microorganisms. Concanavalin A (Cona) is the most widely used lectin. Canavalia gladiata (Jacq.) DC) dry seed was used as raw material to optimize the extraction and purification process of concanavan lectin, and its oligosaccharide chain structure was preliminarily studied, including the following parts: 1. Separation, purification and extraction of concanavan lectins 500g seeds were first crushed and then filtered through 60 meshes, then degreased with petroleum ether at low boiling point (30 ~ 60 鈩，

本文编号：2065926