三聚氰胺致NRK-52e细胞氧化应激与p38MAPK通路介导细胞凋亡的研究

发布时间：2018-06-27 00:21

本文选题：三聚氰胺 + trolox　；参考：《湖南农业大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的研究三聚氰胺导致大鼠肾肾小管上皮细胞(NRK-52e)氧化损伤的程度和细胞凋亡情况以及Trolox对NRK-52e细胞的保护作用和p38MAPK通路在三聚氰胺致NRK-52e细胞凋亡过程中的作用。方法将三聚氰胺直接溶解于DMEM培养基中,分别稀释至40mM,30mM,24mM,16mM,8mM,0mM,通过MTT试验确定三聚氰胺对该细胞的半数抑制浓度(IC50)。根据三聚氰胺对该细胞的IC50选择三个剂量24mM,16mM,8mM作为实验组,并每组都设立向对应的Trolox保护组,、其中Trolox的终浓度为5mM。用三聚氰胺和Trolox于培养基中混匀作用于细胞8h后,收集细胞培养液并将细胞裂解收集细胞裂解液。对细胞裂解液分别采用氮蓝四唑显色法(NBT法)检测样品中总SOD活性、紫外比色法检测样品中的GSH-Px的活性、硫代巴比妥酸法(TBA法)检测样品中的MDA含量。另外,对于细胞培养液采用2,4-二硝基苯肼法检测其中的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性。采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧的水平。通过免疫细胞化学方法检测p38和磷酸化p38(p-p38)在细胞内的表达情况。另外,用western blot方法对细胞内p38和p-p38两种蛋白的表达进行定量检测。最后,通过流式细胞术检测三聚氰胺致NRK-52e细胞凋亡的水平以及分别添加trolox和SB203580后细胞凋亡水平的变化。结果三聚氰胺对NRK-52e细胞的IC50为28.22mM。经trolox处理后,IC50为33.05mM。在氧化损伤指标的检测中发现,随着三聚氰胺浓度的升高抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性下降。相对于空白组,低剂量组中SOD、GSH-Px活性下降显著(P0.05),中、高剂量三聚氰胺可以导致细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性下降极显著(P0.01)。同时,各组MDA的含量有所升高。与对照组相比,低剂量显著升高(P0.05),中、高剂量组升高极显著(P0.01)。在Trolox保护组中,中剂量保护组SOD的活性显著高于中剂量毒素组(P0.05)；高剂量保护组GSH-Px的活性极显著高于对应毒素组,而MDA含量也显著低于毒素组(P0.05)。另外,培养液中LDH活性也随着三聚氰胺的浓度增加而不断升高,其中中剂量毒素组显著高于对照组(P0.05),高剂量毒素组极显著高于对照组(P0.01)。在Trolox保护组中,低中剂量保护组的LDH活性显著低于其毒素组(P0.05)。细胞中活性氧的水平,中、高剂量组极显著高于空白组(P0.01),而中剂量保护组活性氧水平显著低于毒素组(P0.05)。经流式细胞术检测细胞凋亡时发现,NRK-52e细胞的凋亡率随着三聚氰胺浓度的升高而不断增加,差异显著(P0.05)。经trolox处理后,细胞凋亡率显著下降(P0.01)。免疫细胞化学法检测发现,p38蛋白在不同处理组均有表达,其中以三聚氰胺组表达量最多。p-p38蛋白的表达出现在三聚氰胺处理组,说明只有出现凋亡信号时,p38蛋白才会被磷酸化从而发生生物学作用。与三聚氰胺组相比,经SB203580处理后细胞的p-p38蛋白的表达量显著下降(P0.05)。同样,经SB203580处理后的细胞凋亡率也比对应的毒素组降低,说明SB203580通过阻断p38蛋白磷酸化成p-p38,使其不能发挥生物学作用而降低细胞的凋亡率。结论三聚氰胺可以降低抗氧化酶的活性,加速细胞的脂质过氧化程度,破坏了细胞膜的完整性。同时,三聚氰胺还可以促进细胞产生过多的活性氧,这也可能是引起细胞损伤的重要因素之一。另外,在加入保护剂Trolox后,三聚氰胺造成的氧化损伤程度有所降低,并且trolox可以通过提高抗氧化酶的活性、清除细胞内氧自由基来保护细胞,使细胞凋亡发生的几率降低。另外,三聚氰胺致NRK-52e细胞凋亡可能与p38MAPK通路有关,阻断p38MAPK可以阻断三聚氰胺所致的细胞凋亡现象。
[Abstract]:Objective To study the extent of oxidative damage of renal tubular epithelial cells ( NRK - 52e ) in rats induced by melamine and the protective effects of Trolox on NRK - 52e cells and the role of p38MAPK pathway in the apoptosis of NRK - 52e cells .

Methods The activity of p38 and p38 ( p - p38 ) in the cells was determined by MTT assay . The activity of p38 and p38 ( p - p38 ) in the cells was determined by MTT assay .

Results The IC50 of melamine on NRK - 52e cells was 28.22 mM . After trolox treatment , the IC50 was 33.05 mM . The activity of SOD and GSH - Px decreased significantly ( P0.01 ) .
The activity of GSH - Px was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . In the Trolox protection group , the activity of P - p38 protein was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) .

Conclusion melamine can reduce the activity of antioxidant enzymes , accelerate the lipid peroxidation of cells and destroy the integrity of cell membrane .
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【参考文献】