hAAT基因对小鼠iPSCs及其分化为胰岛素分泌细胞的免疫保护作用

发布时间：2018-06-28 08:16

  本文选题：α1-抗胰蛋白酶 + 诱导多能干细胞　； 参考：《暨南大学》2012年博士论文

【摘要】：目的：研究发现诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）移植后仍存在免疫原性，为解决iPSCs及其诱导分化的胰岛素分泌细胞（insulin-producingcells，IPCs）在治疗糖尿病过程中出现的免疫排斥问题，本研究在构建小鼠iPSCs基础上，导入人α1-抗胰蛋白酶（Alpha1-antitrypsin，AAT）基因建立iPSCs-hAAT系。随后将小鼠iPSCs和iPSCs-hAAT诱导分化为IPCs。观察hAAT对iPSCs免疫原性的影响，以及IPCs在同种异体移植治疗糖尿病小鼠时，hAAT对IPCs免疫保护性作用。 方法：①小鼠iPSCs的建立：用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂对plat-E细胞进行转染和逆转录病毒包装，用含有Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒上清感染C57（Oct4-GFP）小鼠MEFs，将其重编程为小鼠iPSCs，，并进行相关鉴定。②hAAT对小鼠iPSCs的免疫保护作用：用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将hAAT基因导入小鼠iPSCs，通过G418筛选得到抗性克隆，经WesternBlot进行鉴定，获得稳定表达hAAT的小鼠iPSCs-hATT。通过CTL实验，ELISA法和RT-PCR检测炎性因子的表达，流式细胞术检测细胞凋亡，观察hAAT对小鼠iPSCs免疫原性的影响。③小鼠iPSCs诱导分化为IPCs：将iPSCs和iPSCs-hATT两种细胞，在体外通过添加RA、ActivinA、N2、B27、bFGF、HGF和nicotinamide等物质诱导分化为IPCs，观察细胞形态的变化，细胞免疫荧光法，RT-PCR法和葡萄糖刺激实验对其进行鉴定。④hAAT在同种异体细胞移植治疗糖尿病小鼠过程中对iPSCs来源的IPCs的免疫保护作用：将iPSCs和iPSCs-hATT来源的IPCs移植到BALB/c糖尿病小鼠的左肾包膜下。检测移植后血糖变化、血清胰岛素水平、葡萄糖耐受实验、移植部位病理学变化，观察hAAT在糖尿病治疗中对IPCs的免疫保护性作用。 结果：①诱导获得的小鼠iPSCs细胞形态与小鼠ESCs相似，碱性磷酸酶染色呈现深紫红色，阳性率在90%以上。能够表达小鼠ESCs的一些干性基因和蛋白，包括SSEA-1、Nanog和Oct4。将小鼠iPSCs移植到裸鼠的腹股沟，能够形成具有3个胚层分化能力的畸胎瘤。②转染hAAT基因后，经G418筛选，获得的iPSCs-hAAT细胞，经Western Blot检测可稳定表达hAAT蛋白。将iPSCs和iPSCs-hAAT分别与同种异体淋巴细胞混合培养，iPSCs-hAAT组较IPCs组淋巴细胞IL-4的分泌量明显增高（P0.05），IFN-γ的分泌量明显降低（P0.05）。CTL实验发现，iPSCs-hAAT组细胞凋亡率明显低于iPSCs组（P0.05）。RT-PCR检测炎性因子表达，发现iPSCs-hAAT组细胞CRP表达量较iPSCs组明显升高，IL-1β和IL-6表达较iPSCs组明显降低。③在三步法诱导分化为IPCs过程中，iPSCs状态发生了改变，从贴壁生长状态成为悬浮生长状态，形成典型的拟胚体。随后在1%Matrigel培养皿中细胞向四周缓慢展开，形成类似细胞团样的结构。RT-PCR检测两种来源的IPCs均表达PDX1和Insulin基因。免疫荧光检测IPCs表达PDX1，Insulin和NKX6.1阳性蛋白。葡萄糖刺激实验，IPCs能够分泌胰岛素和C肽。④iPSCs和iPSCs-hATT来源的IPCs移植治疗糖尿病小鼠，移植后第3天开始均可使血糖降至正常小鼠血糖水平，与iPSCs来源的IPCs组相比，iPSCs-hAAT来源IPCs组小鼠维持正常血糖水平时间明显延长，小鼠血清胰岛素水平较高。糖耐量实验，iPSCs-hAAT来源IPCs组小鼠具有更好的血糖调控能力。病理学观察发现，移植后第14天，来源于小鼠iPSCs-hAAT的IPCs移植组，移植部位结构正常，炎症反应很弱，有极少量淋巴细胞和单核细胞浸润。来源于小鼠iPSCs的IPCs移植组，移植部位出现较明显的炎症细胞浸润。移植28天后，小鼠iPSCs来源的IPCs移植组，移植部位炎症反应的范围加大，炎症细胞浸润的情况加重。小鼠iPSCs-hAAT来源的IPCs移植组出现了一定范围的炎症反应，但相比之下，其炎症细胞浸润的情况明显较轻。 结论：①通过体细胞重编程技术成功构建得到了小鼠iPSCs。②获得稳定表达hAAT蛋白的小鼠iPSCs-hAAT。hAAT通过抑制炎症因子的表达，抗凋亡发挥对iPSCs的免疫保护作用。③将小鼠iPSCs和iPSCs-hAAT诱导分化为有功能的IPCs。④iPSCs-hAAT来源的IPCs移植治疗糖尿病小鼠，hAAT对移植的IPCs具有一定免疫抑制作用，可有效延长IPCs存活时间，从而发挥胰岛β细胞治疗糖尿病的效果。
[Abstract]:Objective : To investigate the immunogenicity of induction pluripotent stem cells ( iPSCs ) after transplantation . In order to solve the problem of immune rejection in the treatment of diabetes mellitus , the induction of the expression of human 伪 1 - antitrypsin ( APCs ) in the treatment of diabetes mellitus was investigated . The effect of hAT on the immunogenicity of iPSCs was observed and the protective effect of hAPCs on IPCs was observed when the mice were treated with allotransplantation .

Methods : 鈶

本文编号：2077336