氧化应激条件下PRAK参与Prx1磷酸化调控的研究

发布时间：2018-07-06 15:48

  本文选题：氧化应激 + 磷酸化　； 参考：《东北林业大学》2012年硕士论文

【摘要】：氧化应激(oxidative stress)是指机体在遭受各种有害刺激时,体内自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡,氧化程度超出氧化物的清除,导致活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在体内蓄积而引起细胞毒性,从而导致组织损伤的过程。氧化应激是导致细胞损伤的最主要原因,并伴随许多疾病(包括心血管疾病、自身免疫病、神经退行性疾病、癌症及衰老等)的发生和发展。适量的ROS对细胞免疫应答非常关键,除在有丝分裂的应答过程中发挥作用,同时也参与了对抗感染原及一系列细胞信号转导过程。但在某些病理情况下,ROS的水平超出了细胞的抗氧化能力,机体就会启动氧化应答,通过一系列的抗氧化机制来维持体内氧化还原的动态平衡,如抗氧化蛋白和修复蛋白的大量产生。如果这种平衡被打破,体内自由基大量累积,同时机体的抗氧化防御能力下降,则会引发氧化应激,直接造成生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损伤,导致细胞死亡或凋亡及组织损伤,最终导致疾病的发生。因此,细胞内的抗氧化酶类对于维持细胞内这种氧化还原的动态平衡具有至关重要的作用。 过氧化物酶(Peroxiredoxins, Prxs)是生物体内有着广泛表达的抗氧化酶,通过催化H202和脂质氢过氧化物还原,避免细胞在氧化应激过程中受到进一步损伤。目前已知哺乳动物中至少存在六种Prx亚型(Prx Ⅰ～Ⅵ),根据参与催化反应的半胱氨酸残基的数目和位置,可分为三个亚类：典型的2-Cys Prxs (Prx Ⅰ～Ⅳ),非典型的2-Cys Prx (Prx Ⅴ)和1-Cys Prx (PrxⅥ)。Prx1属于典型的2-Cys Prxs,因为在其结构中有两个具有氧化还原活性的半胱氨酸残基。在催化反应过程中,氧化性的半胱氨酸(Cys-SH)残基攻击过氧化底物并将其还原,自身则被氧化为半胱氨酸次磺酸(Cys-SOH),然后与另一分子Prxl羧基末端还原性的半胱氨酸(Cys-SH)残基反应,形成分子间二硫键。此时,Prx1可以在硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx),硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)和NADPH组成的还原系统下,重新被还原,高效地催化过氧化物还原,在氧化应激过程中发挥重要作用。 大量研究证实,Prx1不仅能以二聚体的形式存在,发挥过氧化物酶的作用,还可以十聚体的形式存在,充当分子伴侣的角色。这种结构上的变化赋予了Prx1功能上的多样性,进而参与了体内多种与氧化相关的细胞信号转导通路的调节,如第二信使H202介导的信号通路,凋亡信号调节激酶1(ASK1)介导的信号通路,PTEN/AKT介导的信号通路,c-Jun氨基末端激酶(JNK)介导的信号通路,雄激素受体(AR)介导的信号通路以及p38/JNK应激活化蛋白激酶(SAPK)介导的信号通路等。因此,对Prx1功能的研究不仅有助于我们全面地认识其功能,而且对于多种相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。 随着蛋白质组学研究的深入,我们逐渐认识到大量蛋白总是通过与其它蛋白分子发生相互作用或是通过一系列的翻译后修饰过程(尤其是磷酸化)参与细胞的信号转导过程。其中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路在维持细胞的正常生理功能,例如生长、发育、分化及凋亡中具有重要作用。一系列对真核细胞的研究表明,该通路在细胞应激反应中也起到关键作用。已知p38MAPK可以被多种刺激激活,如ROS、紫外线辐射、热休克、细胞因子等,激活之后可以通过磷酸化不同的底物,例如一方面通过活化转录因子2(activating transcription factor-2,ATF2)、肌细胞增强因子2C(myocyte enhance factor2C, MEF2C)、活化转录因子如C/EBP同源蛋白(C/EBP homogolous protein, CHOP10)等来调节参与细胞反应的基因转录表达,另一方面还可激活胞内的一些蛋白激酶如p38调节／激活蛋白激酶(p38regulated/activated protein kinase, PRAK)、MAPK激活蛋白激酶2/3(MAPK-activated protein kinase2/3, MK2/3)、MAPK相互作用激酶1/2(MAPK-interacting kinasel/2, MNK1/2)等来参与许多重要的生物学过程,包括细胞信号转导、细胞骨架重构、应激和生长因子诱导的基因表达等。 生物体的生命活动与蛋白质的动态变化是密切相关的,很多情况下某些蛋白质的绝对量并不发生明显的变化,而是通过各种翻译后修饰来发挥生物学功能的。蛋白质的磷酸化修饰是非常重要的一种翻译后修饰,最常发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸位点上,引起蛋白性质的变化、改变蛋白的定位、增强蛋白的靶向降解,或者影响蛋白与蛋白之间,蛋白与核酸之间的亲和能力等,这些变化最终会导致许多生物过程的级联放大,参与多种生物学过程。当前对蛋白磷酸化的研究绝大多数是基于电泳技术,利用抗磷酸化蛋白的抗体进行Western blot检测,具有分辨率高、特异性好的优点。但是,对于未知蛋白,在不知道具体磷酸化位点的情况下,由于磷酸化抗体的不特异,很难用该方法进行检测。荧光双向差异凝胶电泳(Fluorescent two di-mensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术的出现为蛋白质组的研究提供了有力工具。蛋白磷酸化后会引起的等电点变化,在二维胶上发生水平迁移,表现为等电点不同的一串同源蛋白质点。挖取发生磷酸化迁移的蛋白点,利用一级质谱结合串联质谱就可确定磷酸化位点。这一技术的出现和成熟,为蛋白质磷酸化修饰位点的鉴定提供了有力的工具。 在实验室前期对PRAK的研究中发现,受到外源性过氧化氢刺激时PRAK-/-细胞凋亡率明显高于PRAK+/+细胞,表明PRAK蛋白在细胞发生氧化应激时可能扮演着重要的角色。为了进一步探讨其作用机制,接下来用强氧化剂亚砷酸钠分别刺激PRAK和PRAK+/+细胞,富集磷酸化蛋白,做双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)及质谱鉴定,发现在PRAK+/+细胞中,Prxl的磷酸化水平明显升高,而在PRAK-/-细胞中,Prxl的磷酸化水平变化不大。同时有文献报道,Prx1的过氧化物酶活性与其磷酸化水平有密切的关系。鉴于PRAK是MAPK信号通路下游的一个蛋白激酶,提示PRAK可能通过调控Prx1的磷酸化,从而调节Prxl的过氧化物酶活性,参与细胞氧化应激反应。因此本实验旨在利用免疫印迹结合2D-DIGE技术鉴定氧化应激过程中PRAK对Prx1磷酸化水平的影响,并通过由酵母硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)、酵母硫氧还蛋白还原(thioredoxin reductase, TrxR)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)组成的yTrx活性检测系统考察磷酸化修饰对Prx1过氧化物氧化还原酶活性的影响,进而揭示细胞氧化应激过程中PRAK对Prxl的调控机制。 通过本课题研究,我们得出以下结论： 1.成功构建了pET14b-Prx1重组质粒并进行原核表达纯化,获得了His-Prxl蛋白。 2.进行体外激酶反应,用Western Blot技术对Prxl体外的磷酸化水平进行检测,发现PRAK对Prx1的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基都没有明显的磷酸化现象。结合2D-DIGE技术对Prxl的磷酸化水平进行检测,没有发现明显的pI差异蛋白点,提示PRAK对Prxl可能没有直接的磷酸化调节作用。 3.培养PRAK-/-、PRAK+/+细胞,分别给予NaAsO2刺激45min后裂解细胞获取蛋白,进行Western Blot检测,结果发现PRAK-/-、PRAK+/+细胞中Prxl的苏氨酸位点均未发生明显磷酸化；PRAK-/-细胞中Prx1丝氨酸位点存在着一定水平的磷酸化,但其水平低于PRAK+/+细胞中Prx1丝氨酸水平,提示PRAK的存在对Prxl的丝氨酸磷酸化有促进作用,但该作用是否受到氧化应激条件的影响,尚不明确。PRAK-/-细胞中Prxl酪氨酸位点未发生明显磷酸化,而PRAK+/+细胞Prxl酪氨酸位点发生明显磷酸化,并且其酪氨酸磷酸化水平在受到氧化刺激后有所增强。提示PRAK的存在对Prx1的酪氨酸磷酸化水平亦有影响,且与氧化刺激过程相关联。 4.提取酵母细胞基因组,成功构建了pET14b-yTrx1P、ET14b-yTrxR重组质粒,并原核表达纯化获得His-yTrx1、His-yTrxR蛋白。 5.优化yTrx活性检测系统的反应条件,并对纯化的Prx1的过氧化物酶活性进行了检测,证明成功建立了该活性检测系统。 6.利用yTrx活性检测系统,发现PRAK+/+比PRAK-/-细胞内Prxl的过氧化物酶活性要强,而当受到强氧化剂NaAsO2刺激后,Prxl的活性降低。提示：PRAK可能是通过调控Prx1的磷酸化水平,从而调节Prx1的过氧化物酶活性,造成H202等第二信使分子的瞬时累积,启动其下游细胞信号通路,进而参与细胞氧化应激反应。
[Abstract]:Oxidative stress refers to the serious imbalance between the generation of free radicals in the body and the anti - oxidation defense when the organism is subjected to various harmful stimuli . The oxidation degree exceeds the oxidation resistance of the cells .

In the process of catalytic reaction , there are at least six Prx isoforms ( Prx 鈪，

本文编号：2103291