内质网源性转录因子CHOP在缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞炎症反应中的作用和机制研究

发布时间：2018-07-12 11:54

本文选题：内质网应激 + CHOP　；参考：《第三军医大学》2011年硕士论文

【摘要】：急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是严重创伤、挤压综合征以及多种疾病所导致的临床急危重症,一旦发生急性肾衰竭(acute renal failure,ARF),死亡率高达40%～60%。缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)是急性肾损伤的重要原因之一,炎症反应是缺血再灌注引起急性肾损伤的重要机制。肾小管上皮细胞作为缺血再灌注损伤关键效应细胞,是肾组织炎症介质的主要来源。核因子-κB(nuclear factorκB, NF-κB)是调控炎症细胞因子表达的关键转录因子,在引发炎症瀑布效应中发挥重要作用。尽管研究发现NF-κB与急性I/R肾损伤炎症发生发展具有密切关系,但抑制其活性并不能完全阻断肾组织炎性损伤。因此,进一步揭示I/R引起肾组织炎症反应失控的途径,对探明急性肾损伤发生机制和制定新的防治措施具有重要意义。内质网是细胞内最大的细胞器,对维持细胞内稳态起重要作用。缺氧、低糖以及能量匮乏等因素均可引起过度内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。已证实,过度ERS不仅是缺血性心、脑组织损伤的重要机制,也与急、慢性炎症疾病密切相关。近年研究发现,I/R可引起肾组织过度ERS,但其在缺血再灌注肾损伤中的作用与机制尚不明确。CHOP是内质网应激特异的转录因子,属C/EBP转录因子家族成员,它是ERS信号途径中调控细胞凋亡的重要因子。最新研究发现,急性肺炎、胰腺炎和结肠炎动物模型中,chop基因敲除小鼠caspase-11 mRNA和蛋白表达明显减少、caspase-1活性显著降低、巨噬细胞和炎症细胞TNF-α和IL-1β浸润明显减少,提示CHOP-炎性caspase途径在急性炎症疾病中具有重要作用。已证实,IL-1β是炎症反应早期产生的前炎症细胞因子,炎性caspase负责剪切IL-1β前体成为成熟的IL-1β,而活化的IL-1β反过来通过激活NF-κB放大炎症瀑布效应。据此,我们推测,CHOP通过炎性caspase途径在转录后水平调控IL-1β活化可能是缺血再灌注肾损伤炎症反应的重要机制。本课题通过建立大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E的缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)损伤模型,探明CHOP-caspase途径在缺血再灌注肾损伤炎症反应中的作用与机制,为阐明急性缺血性肾损伤发生机制以及寻找新的治疗策略提供科学依据。一、实验方法 1.细胞培养大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK-52E)用含5%胎牛血清的DMEM液于37℃、5%CO2和95%空气的恒温培养箱培养。 2.缺氧复氧细胞模型的制备当细胞密度达95%时用无血清DMEM同步化细胞24 h,换用无血清无抗生素磷酸盐缓冲液于37℃、含有1%(体积分数)O2+94% N2 +5%CO2混合气的37℃缺氧箱(Modular Incubator Chamber)中缺氧4 h。复氧时,将培养液换为正常培养基,于37℃、5% CO2+95%空气的恒温培养箱内培养1、3、6、12、24 h,收集细胞及培养液上清。 3.细胞转染 NRK-52E以105/孔传代于六孔板,培养于含5%FBS不含抗生素的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2孵箱培养至密度达50%-60%。分别以5μL脂质体Lipofecta mine? 2000加8μL对照siRNA或8μL CHOP siRNA转染NRK-52E细胞24 h,进行缺氧复氧12 h。采用RT-PCR和Western blot方法评价转染效率。 4.细胞分组实验分为两大组:正常对照组、H/R1 h组、H/R3 h组、H/R6 h组、H/R12 h组、H/R24 h组;正常对照组、对照siRNA组、CHOP siRNA组、H/R12 h组、对照siRNA+H/R12 h组和CHOP siRNA + H/R12 h组。 5.检测指标与方法 5.1细胞活力测定常规生化方法测定细胞培养液上清乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的含量。 5.2 RT-PCR法检测细胞caspase-11、caspase-1以及IL-1βmRNA表达水平 TRIZOL法提取各组细胞总RNA ,在20μL反应体系中进行逆转录反应,以cDNA为模板,进行核酸定量。以β-actin作为内参对照,引物序列如下:chop上游5'GGGAAACAGCGCATGAAGGA3',下游5'GCGTGATGGTGCTGGGTACA3' ,扩增产物为221 bp ; caspase-11上游5'ACGGCTGAGGGCATGGAATC3' ,下游5'AGGCCTGCACAATGATGACTTT3' ,扩增产物为235 bp ; caspase-1上游5'TCGGGAGTATGGGAAGGTTGAG 3',下游5'TCCCTTATCCAAAATGCATGCTA 3',扩增产物为290 bp ; IL-1β上游5'CGTGGCACATTCTGGTCAAA3' ,下游5'CTCGTGACCCCCCTGAATC3'扩增产物为220 bp ;β-actin上游5'ACCCCGTGCTGCTGACCGAG3',下游5'TCCCGGCCAGCCAGGTCCA3',扩增产物为249 bp。采用20μL反应体系在ABI 7500实时荧光定量基因扩增仪进行PCR扩增。扩增条件为:预变性94℃5 min后,进行40个循环反应:变性94℃30 s ,退火57℃30 s ,延伸72℃45 s。对PCR反应过程中每一循环荧光信号进行实时监测,获得Ct (cycle threshold)值。采用RT-PCR相对定量方法对2 -ΔΔCt进行统计分析。 5.3 Western blot法检测GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1以及IL-1β蛋白的表达收集细胞,提取蛋白,考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。将含有50μg总蛋白的提取液与4×SDS加样缓冲液混匀, 100℃加热7 min变性,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移至PVDF膜上;5%脱脂牛奶室温封闭2 h ,加入一抗GRP78(1:1 000)、CHOP(1:200)、caspase-11(1:200)、caspase-1(1:1000)、IL-1β(1:200),4℃过夜;TBST缓冲液漂洗10 min×3次;加入辣根过氧化物酶标记二抗(1:1 0 000),室温孵育1 h ;TBST缓冲液漂洗6 min×5次后,暗室中加ECL发光试剂(Pierce公司),X光胶片曝光,常规方法显影、定影。凝胶成像和化学发光分析系统进行灰度分析。以β-actin作为内参照,GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1、IL-1β蛋白含量分别用GRP78/β-actin、CHOP/β-actin、caspase-11/β-actin、caspase-1/β-actin、IL-1β表示。 5.4 ELISA检测IL-1β的表达采用ELISA试剂盒检测各组细胞培养液上清IL-1β水平。 5.5细胞免疫荧光检测肾小管上皮细胞CHOP和caspase-11的表达收集细胞,PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定细胞爬片30 min, PBS漂洗3次,每次5 min; 0.25% triton X-100破膜10 min,PBS漂洗3次,每次5 min;用CHOP、caspase-11抗体分别孵育或共同孵育,4℃过夜;第2 d PBS漂洗3次,每次5 min;分别用FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:20)或Cy3标记的山羊抗兔IgG(1:50) 37℃孵育1 h, PBS漂洗3次,每次5 min; DAPI染液染细胞核3 min,PBS漂洗3次,每次5 min;封片剂封片。激光共聚焦扫描显微镜下观察并照相。二、结果 1. H/R引起肾小管上皮细胞炎性损伤与过度内质网应激的关系 1.1 H/R引起肾小管上皮细胞炎性损伤细胞损伤变化:与对照组相比,细胞上清LDH水平于H/R1 h开始增加,于复氧12 h达高峰,复氧24 h开始下降但仍高于对照组(P 0.05)。细胞上清活性IL-1β表达变化:与对照组相比,H/R1 h后细胞上清IL-1β水平开始增加,于复氧12 h达高峰,复氧24 h开始下降但仍高于对照组(P 0.05)。 1.2 H/R后肾小管上皮细胞GRP78、CHOP的表达变化 GRP78表达变化:H/R后1 h开始升高,12 h达到峰值,24 h开始下降,但仍高于对照组水平(P 0.05)。 CHOP表达变化:对照组CHOP有基础水平表达,H/R1 h时开始增加,H/R6 h时显著增多,H/R12 h达峰值,H/R24 h开始下降但仍高于对照组水平(P 0.05)。免疫荧光结果显示,对照组肾小管上皮细胞CHOP位于细胞浆,表达量较低,H/R12 h后CHOP位于细胞核,表达量明显增多。 2. H/R对肾小管上皮细胞CHOP、炎性caspase、IL-1β表达的影响 2.1 H/R后肾小管上皮细胞caspase-11、caspase-1、IL-1β的表达变化 Caspase-11、caspase-1以及IL-1β表达变化:对照组caspase-11、caspase-1、IL-1β前体均有基础水平表达,H/R1 h时开始增加,H/R6 h时显著增多,H/R12 h达峰值,H/R24 h开始减少;活性caspase-11、caspase-1、IL-1β在H/R1 h时开始增加,H/R12 h达峰值,H/R24 h开始减少但仍高于对照组水平(P 0.05)。 2.2 H/R后肾小管上皮细胞CHOP和caspase-11时空表达变化正常情况下,CHOP和caspase-11位于肾小管上皮细胞细胞浆,有基础水平表达;H/R12 h时,CHOP表达增加且发生核转位,caspase-11表达增加,两者在缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞中共表达。 3. CHOP基因沉默对H/R肾小管上皮细胞炎性损伤的影响 3.1 CHOP基因沉默显著抑制CHOP的表达 CHOP siRNA显著抑制了肾小管上皮细胞CHOP mRNA、蛋白的表达,抑制效率分别为60.38%、68.83%(P 0.05)。 3.2 CHOP基因沉默显著减轻H/R肾小管上皮细胞炎性损伤细胞损伤变化:与H/R12 h组比较,CHOP siRNA显著减轻缺氧复氧损伤后肾小管上皮细胞损伤,细胞培养上清中LDH水平明显减少(P 0.05)。细胞上清活性IL-1β表达变化:与H/R12 h组比较,CHOP基因沉默后H/R12 h细胞培养上清中活性IL-1β水平明显减少(P 0.05)。 4. CHOP基因沉默对肾小管上皮细胞H/R损伤后GRP78、CHOP、炎性caspase以及IL-1β表达的影响 CHOP siRNA显著抑制H/R诱导的肾小管上皮细胞CHOP蛋白的表达(P 0.05),对GRP78蛋白表达无明显影响。 CHOP基因沉默可显著抑制H/R12 h肾小管上皮细胞caspase-11 mRNA和蛋白的表达(P 0.05)、减少活化的caspase-1和IL-1β蛋白水平(P 0.05,P 0.05)。提示CHOP基因沉默能通过抑制炎症caspase通路的活化,显著减轻肾小管上皮细胞炎症反应,减轻细胞损伤。三、结论缺氧复氧可以激活肾小管上皮细胞过度内质网应激,活化CHOP放大炎症瀑布效应。CHOP通过炎性caspase途径在转录后水平调控IL-1β的产生,在急性缺血性肾损伤炎症反应中发挥重要作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【引证文献】