人源MST4激酶的初步晶体学分析及其与MO25α的相互作用研究

发布时间：2018-07-26 11:45

【摘要】：MST4(mammalian Ste20-like kinases, MST)是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族STE-20中生发中心激酶GCKⅢ (germinal central kinase)家族的成员,参与细胞的生长、凋亡、细胞极化等生理活动。MST4在N端含有保守的激酶结构域,在C端的调控结构域可调节激酶活性。为了获得磷酸化状态下MST4激酶结构域的晶体结构,本研究首先对表达在大肠杆菌中的人源MST4激酶结构域拟磷酸化突变蛋白MST4(1-300)-D162A-T172/178E进行了纯化、结晶,并利用X射线衍射进行了初步晶体学分析,得到的晶体结构属于P212121空间群,晶胞参数为a=69.63A,b=73.78A,c=127.10A,α=β=γ=90.0°,分辨率达到2.9A。另外,为了研究MST4与M025α的相互作用,本研究设计了MST4的5个片段,包括MST4全长(1-416)、MST4激酶结构域(1-300)、MST4激酶结构域及WEF基序(1-326)、MST4调控结构域(325-416)、以及激酶结构域失活突变体MST4(1-300)-D162A,将他们和M025a分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,运用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析进行纯化,获得了均一、稳定、高纯度的体外表达蛋白。利用这些体外纯化的蛋白进行pull-down和解离平衡常数的测定,发现MST4(1-416)、(1-326)、(1-300)而非MST4(325-416)可以与M025α结合,结合强度也处于同一个数量级,说明激酶结构域(1-300)为M025α结合所必需,且结合强度不受激酶结构域以外区域影响；MST4(1-300)-D162A也可与M025α结合,说明这种结合不依赖于MST4的激酶活性。MST4与M025a共纯化时,全长MST4以4+4的方式与M025a装配,激酶结构域以1+1的方式装配。这些结果初步揭示了MST4与M025α相互作用的结合机制,为MST4-M025a二元复合物的晶体结构解析奠定了基础。
[Abstract]:MST4 (mammalian Ste20-like kinases, MST) is a member of germinal center kinase (GCK 鈪，

本文编号：2145905