NF-κB在脑缺血预处理激活p38MAPK上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受中发挥作用

发布时间：2018-08-25 11:37

【摘要】：目的：预先给予短暂、轻微、不至于引起神经元损伤的脑缺血预处理，可以减少缺血-再灌注损伤，产生脑缺血耐受。脑缺血预处理诱导脑缺血耐受，已被大量的研究所证实，但其发生机制至今尚未阐明。NF-κB是从B淋巴细胞核中检测到的一种能与免疫球蛋к轻链基因的增强子κB序列特异结合的核蛋白因子。非活化状态NF-κB以IκB聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体形式存在于胞浆中，在缺血缺氧等刺激作用下，通过多种信号途径IκB发生磷酸化并与NF-κB解聚，NF-κB被激活，将信息从胞浆传至胞核并启动相关靶基因的转录。此外，有的研究发现，还有一些独立于IκB的信号，如p38MAPK可以对NF-κB进行磷酸化修饰，调节其活性，使其更有效地促进基因转录[12]。我室既往研究发现，脑缺血预处理通过p38MAPK通路上调星形胶质细胞谷氨酸转运体-1（glialglutamate transporter-1, GLT-1）大量表达而诱导脑缺血耐受；NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082剂量依赖性阻断脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。但脑缺血预处理是否通过p38MAPK信号转导途径影响NF-κB信号通路而引起GLT-1的大量表达，尚有待阐明。为此，本实验旨在观察NF-κB在脑缺血预处理激活p38MAPK上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受中是否发挥作用。方法：健康雄性Wistar大鼠（280～320g）198只，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下三部分： 1脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB p50、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的变化具体分组如下：①s ham组(n=27)：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning, CIP）组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉3min，然后恢复血流再灌注；③损伤性缺血（ischemicinsult, II）组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉8min，然后恢复血流再灌注；④C IP+II组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理，再灌注2天后，夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注。各组均分为9个时间点，即假手术或末次缺血后0min、15min、30min、3h、6h、1d、2d、4d、7d（每个时间点n=3）。在规定的时间点，断头取海马脑组织，应用western blot方法来观察NF-κB p50蛋白表达的变化，免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）方法来观察NF-κB p50/p65二聚体复合物表达的变化，采用电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）观察NF-κB DNA结合活性的变化。 2p38MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB p50、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的影响具体分组如下：①D MSO+CIP+II组（n=18）；②SB203580+CIP+II（n=18）。脑缺血预处理前30min侧脑室注射3%DMSO或SB2035805nmol，然后夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理，再灌注2天后，再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，而后恢复再灌注。于末次缺血后即刻（0min）、3h、6h、1d、4d、7d时取海马脑组织（每个时间点n=3），探讨p38MAPK信号转导通路对NF-κB p50蛋白、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的影响。3NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082对脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中GLT-1蛋白表达的影响具体分组如下：①D MSO+CIP+II组（n=18）；②BAY11 7082+CIP+II（n=36）。脑缺血预处理前30分钟侧脑室注射3%DMSO或BAY11 7082，再灌注2天后，夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，而后恢复再灌注。根据BAY11 7082剂量不同，又分成1.25nmol、2.5nmol2个亚组，每个亚组n=18。于末次缺血后即刻（0min）、3h、6h、1d、4d、7d时取海马脑组织（每个时间点n=3），采用Western blot法观察GLT-1蛋白的表达，研究NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082对GLT-1蛋白表达的影响。结果： 1脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB p50的表达及SB203580对其影响采用Western blot方法观察了在脑缺血耐受诱导过程中，大鼠海马CA1区NF-κB p50蛋白的的表达。 Sham组，即刻（0min）时间点NF-κB p50有一定量的表达，但表达量较少。与即刻时间点相比，其余各时间NF-κB p50表达量均未发生明显变化（P0.05）。 CIP组3min全脑缺血后，即刻（0min）时间点NF-κB p50蛋白的表达量较少。与即刻时间点相比，15min、30min时间点其表达有所上调，但差异无显著性（P0.05）；3h、6h时间点其表达明显升高（P 0.05）；其余时间点均无显著差异（P0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，NF-κB p50在即刻时间点既有一定量的表达。与即刻时间点相比，在15min时间点NF-κB p50蛋白表达有所上调（P 0.05），30min时间点达到高峰（P 0.01）；3h、6h、1d、2d时间点此蛋白的表达有所下调，但仍明显高于即刻时间点（P 0.05）；4d、7d时间点NF-κB p50的表达与即刻时间点相比无显著差异（P0.05）。在DMSO+CIP+II组，0min、3h、6h、1d、4d、7d等6个时间点NF-κB p50的表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组NF-κB p50蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P0.05）。表明， p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效抑制脑缺血耐受诱导过程中NF-κB p50的上调。2脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达及SB203580对其影响通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）的方法研究了脑缺血耐受诱导过程中，大鼠海马CA1区NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达。 Sham组NF-κB p50/p65二聚体复合物在0min、15min、30min、3h、6h时间点有一定数量的表达。与0min时间点相比，15min、30min、3h、6h时间点p50/p65二聚体复合物的表达有所上调，但差异无显著性（P0.05）；假手术1d后NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达明显下调。 CIP组3min全脑缺血后，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达量较少。与即刻时间点相比，此二聚体复合物的表达在15min时间点明显上调（P＜0.01）。30min、3h虽有所下降，但仍明显高于即刻时间点（P＜0.05）。6h、1d、2d表达量维持在一定水平，，与即刻时间点相比无显著差异（P0.05）。4d、7d时此二聚体复合物的表达比即刻时间点明显减少（P 0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达量较少。与即刻时间点相比，NF-κB p50/p65复合物在15min、30min、3h表达明显升高（P 0.05），p50/p65核转移明显增强，以30min最为显著。其余时间点与即刻时间点相比，均无显著性差异（P0.05）。在CIP+缺血打击组，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物有一定的表达量，但表达量较少。与即刻时间点相比，此二聚体复合物在15min、30min、3h、6h表达明显上调（P 0.01）；1d、2d时间点其表达虽有所下调，但仍显著高于即刻时间点（P 0.05）。4d、7d时此二聚体复合物的表达与即刻时间点相比，均无显著性差异（P0.05）。在DMSO+CIP+II组中，0min、3h、6h、1d、4d、7d等6个时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组的NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。上述结果表明，5nmol p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效阻断脑缺血耐受诱导过程中核内NF-κB p50/p65二聚体数量的上调。3脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB的DNA结合活性及SB203580对其影响我们采用电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）的方法检测大鼠海马CA1区胞核内NF-κB的DNA结合活性。在CIP组，即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比，NF-κB在15min时活性显著增强，并且达到高峰（P＜0.01）。30min、3h虽有所下降，但仍明显高于即刻时间点（P＜0.05）。6h、1d、2d时结合活性维持在一定水平，与即刻时间点相比无显著差异（P0.05）。4d、7d时NF-κB结合活性比即刻时间点明显降低（P 0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比，大鼠海马CA1区NF-κB活性在15min、30min、3h显著增强（P＜0.01），以30min较为显著；其余时间点均无显著差异（P0.05）。在CIP+缺血打击组，CIP+缺血打击组NF-κB的DNA结合活性。即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比NF-κB活性在15min开始增强，于30min、3h明显增强（P 0.01），在6h达到高峰；1d、2d时间点虽有所降低，但仍显著高于即刻时间点（P 0.05）。4d、7d时间点NF-κB活性与即刻时间点相比无显著差异（P0.05）。在DMSO+CIP+II组中，0min~7d的各个时间点NF-κB的DNA结合活性均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组的NF-κB的活性在各个时间点均显著降低（P 0.01）。上述结果表明，5nmol p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效阻断脑缺血耐受诱导过程中核内NF-κB的DNA结合活性上调。 4脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082对GLT-1蛋白表达的影响采用Western blot方法观察了在脑缺血耐受诱导过程中，NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082对GLT-1蛋白表达的影响。在DMSO+CIP+II组，0min、3h、6h、1d、4d、7d共6个时间点GLT-1的表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，1.25nmolBAY11 7082+CIP+II组GLT-1蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。2.5nmol BAY11 7082亦导致GLT-1蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。上述结果表明，NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082能够显著下调GLT-1的表达。小结： 1在体脑缺血预处理诱导脑缺血耐受过程中，NF-κB被激活，即表现为：NF-κB p50蛋白表达上调；NF-κB发生二聚体化，并由胞浆转位至胞核；NF-κB的DNA结合活性增强。 2p38MAPK的特异性抑制剂SB203580下调该过程中NF-κB p50蛋白的表达、下调NF-κB p50/p65的表达二聚体复合物的表达、抑制NF-κB的DNA结合活性。 3NF-κB的特异性抑制剂BAY11 7082通过抑制NF-κB的活化来阻断脑缺血预处理所诱导的GLT-1表达上调。结论：NF-κB在脑缺血预处理激活p38MAPK上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受中发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【相似文献】