斑马鱼Ror2对汇聚延伸运动调节机理的研究

发布时间：2018-09-01 10:25

【摘要】：Ror2（The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor）是RTKs家族中的一员，为单次跨膜受体，在人类的骨骼发育和癌症发生中发挥了十分重要的作用。在哺乳动物例如小鼠中，Ror2突变体小鼠呈面部畸形，四肢和尾部短小，呼吸系统功能障碍，最终导致新生小鼠致死。在爪蛙中的研究发现，XRor2及其突变体干扰了原肠期的汇聚延伸运动。因此，Ror2在早期胚胎发育过程中可能发挥了重要作用，所以我们利用斑马鱼胚胎体外发育及早期透明等优势，对Ror2在早期胚胎发育中的功能进行深入研究。前人研究已经发现，Ror2在小鼠和爪蛙中作为一类非Frizzled受体，能够与Wnt5a相互作用调节CE运动。 汇聚延伸（CE）运动是原肠胚期的一种重要的细胞运动形式，在脊椎动物早期胚胎发育过程中发挥了十分重要的作用。值得注意的是，多种遗传学证据强调了在斑马鱼胚胎原肠胚期调节CE运动的重要性。虽然Ror2在小鼠和爪蛙中能够与Wnt5a相互作用调节CE运动，然而斑马鱼中，Wnt5a在原肠胚时期的表达量很低，而且Wnt5a敲降后也没有引起CE缺陷的表型。然而斑马鱼中Wnt11的突变体slb显示了缺陷的CE运动，之前的研究发现，斑马鱼Wnt11能够与Frizzled-7和Flamingo相互作用调节细胞运动，那么斑马鱼中Wnt11是否能通过Ror2发挥功能呢？Hiroki Hikasa等研究表明XRor2与XWnt11，Xfz7的共过表达能够协同抑制汇聚延伸运动。生化实验表明，XRor2的胞外结构域CRD能够与XWnt11相结合，这一研究结果为我们提供了一些信息，但是并未有研究报道Wnt11和Ror2体内的相互作用功能。因此，以上的论述使我们提出了一些疑问，在斑马鱼中Ror2是否能够在CE运动中发挥功能? Wnt11对CE运动的调节作用是否是通过Ror2的介导？Ror2与Wnt11是否能够相互结合？这些问题目前还没有得到解答。本研究的目的就是对上述疑问依次进行探讨。 我们首先克隆得到了斑马鱼的Ror2基因，通过序列比对发现斑马鱼Ror2与人、小鼠和爪蛙的Ror2同源性极高。通过RT-PCR分析显示，Ror2为母源性基因，且随后的各胚胎时期均有表达，并且值得一提的是，Ror2在6-9hpf表达量较高，这暗示着Ror2有可能在原肠胚期发挥作用。Ror2的过表达抑制了胚胎在原肠胚期的汇聚和迁移，导致了严重的CE缺陷表型，暗示着Ror2在原肠胚期的CE运动中发挥了一定的调节作用。 Ror2和Wnt11共过表达能协同加强CE缺陷表型，并且原位杂交markers（hgg、dlx3b、ntl）检测也证明了这一结果，这暗示着斑马鱼Wnt11可能通过Ror2调节CE运动。Ror2MOs敲降实验显示，在原肠胚期Ror2敲降后并没有导致CE缺陷，，产生这一结果的原因，我们猜测是由于胚胎中存在Ror2的母源性蛋白，而TB MO并不能将其母源性蛋白封闭住，因此敲降表型不明显。所以，我们随后又改用Ror2dominant negative形式Ror2-TM进行敲降。结果显示，dnRor2能够导致较为严重的CE缺陷，并且随后的时期胚胎眼部间距变窄，甚至出现独眼表型，表型与wnt11/silberblick突变体表型类似，暗示着斑马鱼Wnt11可能会通过Ror2调控CE运动。因此我们同样将Wnt11MO和dnRor2进行低剂量共显微注射，结果同样表明两者的协同加成作用，并且进一步暗示了Wnt11与Ror2的相互作用。而Wnt11mRNA与dnRor2共过表达，显著削弱了Wnt11mRNA引起的CE缺陷的表型，这一研究从另一方面暗示了两者的相互作用性。因此为了直接证明这一假设，我们运用co-ip实验进行验证，结果也证明了Wnt11的确能够与Ror2相结合。为了进一步研究Wnt11通过Ror2调控CE运动过程中发挥重要作用的位点，我们构建了Ror2突变体，结果表明Ror2-Y647和-S863位点均能在此过程中发挥作用。 通过以上研究表明，在斑马鱼中，Wnt11能够与Ror2结合，从而调控了原肠胚期的汇聚延伸运动，而且这一调控作用中Ror2的Y647和S863位点是不可缺少的。这一研究结果不仅进一步认识了汇聚延伸这种重要的细胞运动形式，开拓了脊椎动物中对汇聚延伸运动的研究视野，而且对脊椎动物的早期胚胎发育研究提供了一定的理论依据。
[Abstract]:Ror2 (The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor) is a member of the RTKs family. It is a single transmembrane receptor and plays an important role in human skeletal development and cancer. In mammals such as mice, the Ror2 mutant mice exhibit facial deformities, short limbs and tail, respiratory dysfunction, and ultimately lead to the development of cancer. It was found that XRor2 and its mutants interfered with the convergence and extension of the gastrula. Therefore, Ror2 may play an important role in the early embryonic development, so we used the advantages of zebrafish embryo development in vitro and early transparency to study the function of Ror2 in early embryonic development. Previous studies have shown that Ror2, as a non-Frizzled receptor, interacts with Wnt5a to regulate CE movement in mice and frogs.
Convergence elongation (CE) movement is an important form of cell movement in the gastrula and plays an important role in the early embryonic development of vertebrates. It is noteworthy that genetic evidence underlines the importance of regulating CE movement in the gastrula of zebrafish embryos. Interaction regulates CE movement, however, in zebrafish, Wnt5a expression is low during gastrula embryogenesis, and Wnt5a knockdown does not cause CE deficiency phenotype. However, the mutant SLB of Wnt11 in zebrafish shows defective CE movement. Previous studies have found that Wnt11 interacts with Frizzled-7 and Flamingo to regulate cell transport. Biochemical experiments show that the extracellular domain CRD of XRor2 can be combined with XWnt11, which provides some information for us, but no research has been done. The interaction between Wnt11 and Ror2 in vivo is reported. Therefore, the above discussion makes us question whether Ror2 can play a role in CE movement in zebrafish, whether Wnt11 mediates CE movement through Ror2, and whether Ror2 and Wnt11 can combine with each other. The purpose of this study is to discuss these questions in turn.
We first cloned the Ror2 gene from zebrafish and found that Ror2 was highly homologous to human, mouse and frog by sequence alignment. RT-PCR analysis showed that Ror2 was a maternal gene and was expressed in all subsequent embryonic stages. The overexpression of Ror2 inhibits the convergence and migration of embryos in gastrula, leading to severe CE deficiency phenotypes, suggesting that Ror2 plays a regulatory role in the CE movement in gastrula.
Co-expression of Ror2 and Wnt11 could synergistically enhance CE deficiency phenotype, and in situ hybridization markers (hgg, dlx3b, ntl) test also confirmed this result, suggesting that zebrafish Wnt11 may regulate CE movement through Ror2. Ror2MOs knockdown test showed that Ror2 knockdown did not lead to CE deficiency in gastrula embryo, we guess the reason for this result. The knockdown phenotype was not obvious because of the presence of Ror2 maternal protein in the embryo and the fact that TB MO could not block its maternal protein. Therefore, we then knocked down Ror2-TM in the Ror2 dominant negative form. The results showed that dnRor2 could cause serious CE defects and subsequent changes in the ocular spacing of the embryo. Narrow or even monocular phenotypes, similar to the wnt11/silberblick mutant phenotype, suggest that zebrafish Wnt11 may regulate CE movement through Ror2. Therefore, we also injected Wnt11MO and dnRor2 into low-dose co-microinjections. The results also showed that Wnt11MO and dnRor2 had synergistic additive effects and further suggested the interaction between Wnt11 and Ror2. The co-expression of Wnt11 mRNA and dnRor2 significantly weakened the phenotype of CE deficiency caused by Wnt11 mRNA, which implied the interaction between Wnt11 mRNA and dnRor2 on the other hand. Therefore, in order to directly prove this hypothesis, we used co-Ip experiment to verify the results, which also proved that Wnt11 can indeed combine with Ror2. We constructed a Ror2 mutant through the site of Ror2 which plays an important role in the regulation of CE movement. The results showed that both Ror2-Y647 and -S863 sites can play a role in this process.
In zebrafish, Wnt11 can bind to Ror2, thus regulating the convergence and extension of gastrula embryo, and the Y647 and S863 loci of Ror2 are indispensable in this regulation. This study not only further understands the important cell movement pattern of convergence and extension, but also opens up new avenues in vertebrates. It provides a theoretical basis for the study of early embryonic development of vertebrates.
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R-332

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本文编号：2216909