Dickkopf-1蛋白与经典Wnt信号通路失活在帕金森病模型中的作用研究

发布时间：2018-09-17 16:12

【摘要】：目的：Wnt信号通路在多巴胺能神经元的发育及帕金森病多巴胺能神经元的损伤中发挥着重要作用。本研究旨在观察经典Wnt信号通路的相关蛋白及其抑制剂Dkk1是否在MPP+诱导的PC12细胞中发生改变,并初步探讨其可能机制。 方法：用不同浓度的MPP+作用于PC12细胞,MTT法检测在不同时间细胞的存活率及Western Blot检测不同时间点Dkk、β-catenin和p-Ser9-GSK-3β表达的变化情况。LiCl预处理1h后,再用MPP+作用PC12细胞,同时也检测细胞的存活率及凋亡的情况,检测不同时间点Dkk1. β-cateninn和p-Ser9-GSK-3p表达的变化情况。 结果：①不同浓度的MPP+对PC12细胞作用24h,细胞存活率没有显著变化,高浓度的MPP+对PC12细胞作用48h和72h后细胞存活率有显著变化,并且在1000μMMPP+作用72h后,细胞存活率降至最低45.0%,而1000μMMPP+作用48h和72h对细胞存活率的影响并没有显著性差异。②Western Blot结果显示,在6-24h,MPP+诱导Dkk1的表达显著增加,其表达高峰时间先于细胞的死亡时间,但是Dkk1的水平在48h恢复至正常。MPP+作用8h后,β-catenin的水平开始有降低的趋势,在24h至48h其水平则显著降低,p-Ser9-GSK-3β(GSK-3β的非活化形式)在MPP+作用6-48h减少。③LiCl预处理可显著增加PC12细胞中β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表达。④LiCl预处理减轻MPP+诱导的PC12细胞存活率的减少,Annexin Ⅴ-FITC/PI流式细胞术及TUNEL法显示MPP+诱导的PC12细胞凋亡率的增加也可被LiCl(1mM)减少。 结论：经典Wnt信号通路蛋白和其抑制剂Dkk1可能参与了MPP+诱导的PC12细胞的减少,Dkk1可能通过抑制经典Wnt信号通路蛋白发挥作用。 目的：第一部分实验表明Dkk1在MPP+致PC12细胞损伤模型中的诱导表达先于细胞死亡,本实验旨在探讨Dkk1在MPP+致PC12细胞损伤模型中的机制。 方法：通过对外源性的给予·rhDkkl联合MPP+处理PC12细胞48h后,检测细胞存活率及Wnt信号通路相关蛋白表达的变化情况。通过siRNA技术下调Dkkl在PC12细胞的表达,观察细胞凋亡情况及Wnt信号通路相关蛋白表达的变化情况。 结果：①hDkk1(100ng/ml)与MPP+联合作用细胞48h后检测细胞存活率,结果显示：rhDkkl加重MPP+对PC12细胞的损伤作用,而LiCl预处理1h并不能显著改善两者联合应用引起的细胞损伤作用。②hDkk1促进MPP+诱导的PC12细胞中TH的减少。与MPP+单独处理组相比,两者联合应用β-catenin减少的更多,但p-Ser9-GSK-33β轻微减少。③Dkk1-siRNA可以显著减轻MPP+诱导的PC12细胞的凋亡。④Dkk1-siRNA有效的增加β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表达,同时也显著提高TH的水平。 结论：Dkkl参与了MPP+诱导的PC12细胞的凋亡,其机制可能与抑制经典Wnt信号通路相关。 目的：本实验旨在观察Dkkl在6-OHDA损伤大鼠的帕金森病模型中的作用。 方法：通过脑立体定位仪经MFB给予6-OHDA损伤大鼠,制备帕金森病模型。另有LiCl预处理7d后再给予6-OHDA损伤大鼠组,及通过黑质给予rhDkk1与MFB给予6-OHDA联合损伤大鼠组。术后35d多聚甲醛灌注免疫组化检测各组黑质多巴胺能神经元的损伤情况,并取大鼠腹侧中脑Western Blot检测TH、Dkk1及β-catenin、 p-Ser9-GSK-3β的变化情况。 结果：①6-OHDA损伤组TH阳性的神经元数量明显减少,LiC1预处理组的TH阳性的神经元数量则明显增加；rhDkk1与6-OHDA联合损伤组,与6-OHDA单独损伤组相比,TH阳性的神经元数量则降低的更明显。②Dkk1在6-OHDA损伤的大鼠术后35d腹侧中脑的表达明显增加。③经典Wnt信号通路的抑制在6-OHDA损伤的大鼠腹侧中脑中也被检测到,包括β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的降低,而两者表达水平均可被LiCl升高；rhDkkl与6-OHDA联合应用可进一步加剧β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的减少。 结论：Dkkl在6-OHDA损伤大鼠的腹侧中脑被诱导表达,其可能通过抑制经典Wnt信号通路而促进6-OHDA损伤大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤。
[Abstract]:AIM: Wnt signaling pathway plays an important role in the development of dopaminergic neurons and the damage of dopaminergic neurons in Parkinson's disease.
METHODS: PC12 cells were treated with different concentrations of MPP +. MTT assay was used to detect the survival rate of PC12 cells at different time points and Western Blot to detect the expression of Dkk, beta-catenin and p-Ser9-GSK-3 beta at different time points. Changes in the expression of Dkk1. -cateninn and p-Ser9-GSK-3p were observed.
RESULTS: The survival rate of PC12 cells treated with different concentrations of MPP + for 24 hours had no significant change. The survival rate of PC12 cells treated with high concentrations of MPP + for 48 hours and 72 hours had significant change. After 72 hours of treatment with 1000 mu MMPP + for 72 hours, the cell survival rate decreased to the lowest level of 45.0%, while the effect of 1000 mu mu MMPP + for 48 hours and 72 hours had no effect on the cell survival rate. The results of Western Blot showed that the expression of Dkk1 was significantly increased at 6-24 h, and the peak time of Dkk1 expression was earlier than the time of cell death, but the level of Dkk1 returned to normal at 48 h. After 8 h of MPP + treatment, the level of beta-catenin began to decrease, but decreased significantly at 24 h to 48 h, and p-Ser9-GSK-3 beta (GSK-3 beta) was decreased. LiCl pretreatment significantly increased the expression of beta-catenin and p-Ser9-GSK-3 beta in PC12 cells. LiCl pretreatment reduced the decrease of MPP+induced survival rate of PC12 cells. Annexin V-FITC/PI flow cytometry and TUNEL assay showed that the increase of apoptosis rate of PC12 cells induced by MPP+ could also be induced by LiCl (1mM). Reduce.
CONCLUSION: The classical Wnt signaling pathway protein and its inhibitor Dkk1 may be involved in the decrease of PC12 cells induced by MPP +, and Dkk1 may play a role by inhibiting the classical Wnt signaling pathway protein.
OBJECTIVE: The first part of the experiment showed that Dkk1 induced expression preceded cell death in MPP + induced PC12 cell injury model. The aim of this experiment was to explore the mechanism of Dkk1 induced PC12 cell injury in MPP + induced PC12 cell injury model.
Methods: After 48 hours of exogenous administration of rhDkkl combined with MPP + for PC12 cells, the cell survival rate and the expression of Wnt signaling pathway related proteins were detected.
RESULTS: The results showed that rhDkkl aggravated the damage of MPP + on PC12 cells, but LiCl pretreatment for 1 h could not significantly improve the damage of PC12 cells induced by the combination of hDkk1 (100ng/ml) and MPP +. hDkk1 could promote the decrease of TH in PC12 cells induced by MPP +, and MPP + alone treated PC12 cells. Dkk1-siRNA can significantly reduce the apoptosis of PC12 cells induced by MPP +. 4. Dkk1-siRNA can effectively increase the expression of beta-catenin and p-Ser9-GSK-3 beta, but also significantly increase the level of TH.
CONCLUSION: Dkkl participates in the apoptosis of PC12 cells induced by MPP +, which may be related to the inhibition of classical Wnt signaling pathway.
Objective: To observe the effect of Dkkl on Parkinson's disease model in 6-OHDA injured rats.
METHODS: Parkinson's disease model was established in rats injured with 6-OHDA by brain stereotactic localizer and 6-OHDA by LiCl pretreatment for 7 days. In rats injured with 6-OHDA by rhDkk1 and MFB in substantia nigra, the damage of dopaminergic neurons in substantia nigra was detected by perfusion immunohistochemistry 35 days after operation. The changes of TH, Dkk1, beta catenin and p-Ser9-GSK-3 beta in ventral midbrain of rats were detected by Western Blot.
Results: The number of TH-positive neurons decreased significantly in 6-OHDA injury group, while the number of TH-positive neurons increased significantly in LiC1 preconditioning group. The number of TH-positive neurons decreased more significantly in rhDkk1 and 6-OHDA combined injury group than that in 6-OHDA alone injury group. (3) Inhibition of the classical Wnt signaling pathway was also detected in the ventral midbrain of rats with 6-OHDA injury, including the decrease of beta-catenin and p-Ser9-GSK-3 beta, both of which could be elevated by LiCl; rhDkkl combined with 6-OHDA could further aggravate the decrease of beta-catenin and p-Ser9-GSK-3 beta.
CONCLUSION: Dkkl is induced to express in the ventral mesencephalon of 6-OHDA-injured rats, which may promote the damage of dopaminergic neurons in substantia nigra of 6-OHDA-injured rats by inhibiting the classical Wnt signaling pathway.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R742.5

【共引文献】

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本文编号：2246450