活化的Toll样受体对人内皮（祖）细胞生物学功能的影响及其机制研究

发布时间：2018-10-05 06:32

【摘要】：第一章聚肌胞(PolyⅠ:C)对人脐血内皮祖细胞增殖的影响及其机制研究 第一节人脐血内皮祖细胞表达Toll样受体的研究 目的：分离纯化人脐静脉血来源的单个核细胞并诱导培养为内皮祖细胞,观察Toll样受体在人脐血内皮祖细胞中的表达情况。 方法：采用密度梯度离心法分离人脐静脉血中的单个核细胞,用含多种生长因子的内皮祖细胞专用EBM-2培养基诱导培养,诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,通过形态学、免疫荧光及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测并鉴定细胞的生物学特性；采用RT-PCR法检测静息状态下人内皮祖细胞(EPCs)表达的Toll样受体亚型；检测不同浓度的PolyⅠ:C对内皮祖细胞表达TLR3受体、炎性细胞因子的影响。 结果： 1.分离培养的内皮祖细胞早期以集落为中心呈放射状生长,晚期形成典型的“铺路石”样改变。荧光染色示DiL-acLDL和FITC-UEA-I双染色阳性；RT-PCR法检测示细胞表达干细胞表面标志物CD34、CD133、KDR,证明为内皮祖细胞。 2.静息状态下,内皮祖细胞表达较高水平的TLR1、TLR3、TLR4、TLR6,表达较低水平的TLR2、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10,不表达TLR9。而PolyⅠ:C能上调TLR3的mRNA及蛋白表达,并呈量效关系。 3. PolyⅠ:C通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子IL-1p、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-p的基因表达。 结论：EPCs表达功能性TLR3；PolyⅠ:C能呈剂量依赖性上调TLR3在EPCs的mRNA及蛋白表达,并通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子的mRNA表达。 第二节PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响 目的：观察TLR3的配体PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响。 方法：采用不同浓度的PolyⅠ:C持续干预人脐血内皮祖细胞(EPCs),通过CCK-8细胞增殖试验检测其对EPCs增殖的影响及时间效应；通过流式细胞术检测不同浓度的PolyⅠ:C对EPCs细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响。 结果： 1.与对照组相比,较高浓度PolyⅠ:C(1,10μg/m1)持续作用于脐血内皮祖细胞3天后显著抑制内皮祖细胞增殖；终浓度10μg/ml的PolyⅠ:C呈时间依赖性抑制内皮祖细胞增殖。 2.较高浓度的PolyⅠ:C(1,10μg/m1)显著减少S期和G2/M期细胞比例,并通过下调细胞周期素A,B1,D1,E的表达阻滞细胞周期于G0/G1期而改变细胞周期的时相分布,从而抑制EPCs的增殖。 3. PolyⅠ:C呈剂量依赖性诱导内皮祖细胞凋亡。 结论：高浓度的PolyⅠ:C通过将细胞周期阻滞于G0/G1期并诱导细胞凋亡从而抑制EPCs增殖。 第三节PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的机制研究 目的：阐明PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的具体机制。 方法：利用Caspase8的抑制剂和Caspase9的抑制剂抑制相应的信号分子,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。以不同浓度的TNF-α及IL-1β干预EPCs24h后,CCK-8细胞增殖试验分别检测TNF-α和IL-1β对细胞凋亡的影响。利用IL-1β受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1β的结合位点,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。 结果： 1. Caspase8和9的抑制剂并不能抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。 2.随着TNF-α作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率并无明显增加。 3.随着IL-1p作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率逐步增加,并呈剂量依赖性。使用IL-1p受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1p的结合位点后,再加入PolyⅠ:C干预24h,结果显示高浓度的Anti-IL-1R1可以部分抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。 结论：PolyⅠ:C活化TLR3后通过上调IL-1p的表达诱导EPCs凋亡,而内、外源性细胞凋亡途径及TNF-a不参与PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡 第二章Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的细胞因子表达 第一节Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制 目的：阐明TLR1/2激动剂Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。 方法：以不同浓度的Pam3CSK4干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs), RT-PCR法检测Pam3CSK4对TLR1、TLR2mRNA表达的影响。用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的时间效应及剂量效应。分别用TLR1、TLR2及TLR1阻断剂阻断相应受体的表达,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用Western-blot法检测Pam3CSK4对MAPK家族及NF-κB信号转导通路的活化情况。 结果：Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TLR2的mRNA表达,而对TLR1mRNA表达的影响不明显。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TNF-α、IL-6的基因及蛋白表达量。加入TLR1、TLR2、TLR1/2受体阻断剂后均能明显抑制Pam3CSK4诱导的TNF-a、IL-6的基因表达上调,其中以TLR1/2受体阻断剂的阻断作用最明显。Pam3CSK4与TLR2结合后可以不同程度活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路。 结论：HUVECs表达功能性TLR2；Pam3CSK4与TLR2结合后活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路,从而诱导炎症因子TNF-α、IL-6的分泌,且TNF-α、IL-6的分泌依赖于TLR1及TLR2的表达。 第二节Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的IL-6表达 目的：阐明预处理的TLR1/2激动剂Pam3CSK4重复刺激对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。 方法：以不同浓度的Pam3CSK4预处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用不同TLR受体的配体预处理HUVECs后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,以观察不同TLR受体之间的耐受情况。Western-blot法检测Pam3CSK4重复刺激对MAPK家族及NF-κB信号传导通路的活化情况。RT-PCR法检测Pam3CSK4对负性调节蛋白锌指蛋白A20基因表达的影响,然后用质粒转染试验检测A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌的影响。用Notch信号通路抑制剂抑制相关分子,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌IL-6的影响。 结果：给予HUVECsPam3CSK4预处理后,再给予Pam3CSK4重复刺激可以下调TNF-a的基因及蛋白表达,而对IL-6表达无影响。LPS预处理可以使Pam3CSK4诱导的TNF-α表达下降,而对IL-6表达无影响。Pam3CSK4重复刺激HUVECs能抑制JNK通路的活化,而对p38、ERK、NF-κB信号通路的活化无影响。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调负性调节蛋白锌指蛋白A20的基因表达,A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌无明显影。Notch信号通路抑制剂能部分抑制Pam3CSK4诱导的IL-6分泌。 结论： 1.Pam3CSK4重复刺激可诱导耐受性的TNF-α表达,而诱导非耐受性的IL-6表达。 2.TLR2与TLR4之间存在交叉耐受性。 3.Pam3CSK4可能通过Notch信号通路诱导非耐受性的IL-6表达。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 吴丽娟;刘国栋;陈伟;蒋建新;朱佩芳;;锌指蛋白A20对人单核细胞LPS应答的影响[J];第三军医大学学报;2007年14期

2 崔新华;王z牖，

本文编号：2252372