PIAS2及其相互作用蛋白RACK1参与精子发生的机制

发布时间：2018-10-08 18:46

【摘要】：PIAS(protein inhibitor of activated STAT)蛋白家族是一种能够激活STAT转录活性的抑制蛋白,共包括四个成员：PIAS1、PIAS2、PIAS3和PIASy。其中PIAS2包括PIASxa和PIASxβ两种亚型,两者均特异表达于人睾丸组织中,但目前其在精子发生过程中的作用机制尚未阐明。为此,本课题通过研究PIAS2与其相互作用蛋白RACK1的相互作用机制,以揭示其在精子发生中的作用机制。在前期工作中,通过酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选了与PIAS2相互作用的多种蛋白,其中GNB2L1,即RACK1蛋白,是一个新的相互作用蛋白。RACK1蛋白是有活性的激酶C受体的简称,是一种多功能的支架蛋白,其结构中包含七个WD40的重复序列,研究发现该结构域能与多种激酶及膜受体等相互作用而发挥其功能。本研究通过如下四个方面对PIAS2与RACK1相互作用的机制进行了研究。第一,通过直接酵母双杂交实验,证实了在酵母细胞中PIAS2可以与筛选出的两个RACK1独立克隆相互作用。将pGBKT7-PIAS2分别与捕获质粒pGADT7-RACK1(123-317aa)和pGADT7-RACK1(136-317aa)共转染至酵母细胞AH109中,应用SD/-LTHA/X-a-Gal进行报告基因的检测,结果发现,两个RACK1独立克隆与PIAS2共转染组均能在营养缺陷的培养基上生长,并激活laz报告基因,呈现蓝色。表明酵母细胞中PIAS2与RACK1能够相互作用。第二,分别应用免疫共沉淀和细胞共定位分析确定PIAS2和RACK1在哺乳动物细胞中能够相互作用。首先,由于HeLa细胞中同时表达PIAS2和RACK1蛋白,因此,我们在HeLa细胞总蛋白中分别用鼠抗PIAS2抗体及兔抗RACK1抗体进行了免疫共沉淀,然后分别用兔抗RACK1抗体及鼠抗PIAS2抗体进行Western Blot分析,结果发现,在鼠抗PIAS2抗体的共沉淀产物中能够检测到RACK1蛋白,而兔抗RACK1抗体的共沉淀产物中也能检测到PIAS2蛋白,表明PIAS2与RACK1在哺乳动物细胞中能够相互作用。其次,通过细胞共定位确定两者在细胞中能够相互作用。将真核表达质粒pCS-Myc-PIAS2转染至HeLa细胞中,48小时后,用鼠抗c-myc抗体和兔抗RACK1多克隆抗体进行细胞免疫荧光化学染色分析,结果发现,PIAS2和RACK1蛋白共定位于HeLa细胞的细胞核和细胞质中。同时,我们还分别构建了真核表达质粒pDsRed-Express-1-PIAS2和pEGFP-RACK1,将两者共转染至HeLa细胞中,48小时后用荧光显微镜进行观察,结果显示：pDsRed-PIAS2的红色荧光融合蛋白与pEGFP-RACKl的绿色荧光融合蛋白部分共定位于HeLa细胞中。上述结果提示,在哺乳动物细胞中PIAS2与RACK1能够共定位于细胞中,因而具有相互作用的可能。第三,通过酵母双杂交技术确定了PIAS2与RACK1相互作用的最小区域。根据RACK1全长序列,构建包含了WD3-WD7、WD4-WD7、WD5-WD7、WD6-WD7、 WD7、WD1-WD4、WD1-WD5、WD1-WD6在内共8种长短不等的pGADT7重组质粒,分别与pGBKT7-PIAS2进行直接酵母双杂交分析,并在SD/-LTHA/X-α-Gal培养基上进行报告基因的分析,从而确定了RACK1蛋白中与PIAS2蛋白相互作用的关键区域：WD5-WD7重复结构域。根据PIAS2蛋白的结构域组成,构建了包含mPIAS2(9-242aa)、mPIAS2(9-345aa)、 mPIAS2(243-401aa)、mPIAS2(346-401aa)片段的pGBKT7的重组质粒,分别与pGADT7-RACK1(WD5-WD7)进行直接酵母双杂交实验,并在SD/-LTHA/X-α-Gal上进行报告基因的检测,结果显示,第9-242氨基酸(SAP结构域)和第243-401氨基酸(PINIT和RLD结构域)与RACK1蛋白WD5-WD7结构域相互作用很微弱；PIAS2中第346-401氨基酸(RLD结构域)和第9-345氨基酸(SAP和PINIT结构域)与RACK1蛋白WD5-WD7结构域具有很强的相互作用,表明,PIAS2蛋白中有多个与RACK1相互作用的区域。第四,通过SUMO化修饰分析及过表达细胞系研究两种蛋白相互作用的意义。据报道,PIAS2可以通过SUMO化修饰的方式来调控其相互作用的蛋白,同时,应用生物信息学软件分析发现RACK1蛋白中含有一个典型的SUMO化位点。因此,我们推测PIAS2有可能通过SUMO化修饰RACK1来调控其功能。将pCS-myc-PIAS2(9-401aa)、 pEGFP-PIASxa、pEGFP-PIASxβ分别与pEGFP-UBC9和pEGFP-SUMOI组合瞬时转染HeLa细胞,24小时后收集细胞,提取蛋白,用抗RACK1抗体及抗SUMO1抗体进行Western Blot分析,检测RACK1的SUMO化情况：将pCS-Myc-PIAS2、pEGFP-PIASxα、pEGFP-PIASxp分别与pEGFP-UBC9和pEGFP-SUMO2组合瞬时转染HeLa细胞,用抗RACK1抗体及抗SUMO2抗体进行Western Blot分析,检测RACK1的SUMO化情况,两者共同判断PIAS2是否能够使RACK1发生SUMO化。结果显示,RACK1并没有发生SUMO化修饰,表明PIAS2可能不能对RACK1进行SUMO修饰,因此,PIAS2可能不是通过SUMO化修饰RACK1的方式调控其功能。为进一步探讨PIAS2与RACK1相互作用的意义,我们应用慢病毒系统,构建并包装了PIAS2过表达慢病毒,并将其感染小鼠精母细胞系spd-GC2细胞,获得稳定过表达PIAS2的GC2细胞系,观察PIAS2过表达细胞系对RACK1表达的影响。通过定量Western Blot分析发现,过表达PIAS2蛋白对RACK1蛋白的表达量没有显著的影响。综上所述,我们的研究显示,PIAS2与RACK1蛋白不仅能在酵母细胞中相互作用,也能在哺乳动物的细胞中相互作用。RACK1中与PIAS2相互作用的关键区域为RACK1的WD5-WD7结构域,而PIAS2有多个结构域能够与RACK1相互作用。同时,我们的研究还发现PIAS2可能不是通过SUMO化修饰RACK1调控其功能,过表达PIAS2蛋白对RACK1的表达也没有明显的影响,PIAS2与RACK1蛋白相互作用的意义还有待进一步研究。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R321.1

【共引文献】