免疫调控对慢性HBV复制的影响及其机制的研究

发布时间：2018-10-08 18:59

【摘要】：目的 1、用免疫抑制剂CsA处理BALB/c小鼠，抑制小鼠的免疫功能。再以这些动物为对象，尾静脉高压水注射pAAV/HBV1.2质粒，监测小鼠的病毒血症、抗原血症和抗体反应，探讨免疫抑制剂CsA对HBV复制过程的影响。 2、观察CsA不同处理时间对HBV复制小鼠的病毒复制和抗原表达的影响；同时检测各组小鼠天然免疫和获得性免疫反应，探讨免疫抑制影响HBV复制的机制。 3、用CsA长期处理建立HBV慢性复制的BALB/c小鼠模型，在停止CsA处理后分别对HBV复制慢性化的小鼠予以主动免疫和被动免疫，探讨免疫调节对免疫抑制状态下HBV持续复制的影响。 材料和方法 1、6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自湖北省疾病控制中心。 2、分别用NS或CsA处理BALB/c小鼠，用质粒pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射小鼠，建立HBV复制的小鼠模型。定期采集小鼠血液样本，ECLIA检测血清内HBsAg、HBsAb、HBcAb的水平，同时抽提血清内的HBV DNA，Real-Time PCR检测血清内的病毒滴度。分析CsA处理对HBV复制过程的影响。 3、将BALB/c小鼠分为CsA短期处理（-1至4周）组、CsA持续处理（-1至10周）组以及生理盐水处理组，在不同的时间点采集血液样本或处死小鼠，Elispot检测小鼠脾脏分泌IFN-γ的HBcAg特异性T细胞频率。Real-Time PCR检测小鼠肝组织和脾组织内CD分子和抗病毒相关的细胞因子的mRNA水平。Southern Blot检测肝内HBV的复制中间体。免疫组化检测肝组织内HBcAg的表达水平。分析CsA处理延长HBV复制的免疫学机制。 4、用CsA处理BALB/c小鼠（-1至10周），在0周尾静脉高压水注射质粒pAAV/HBV1.2建立HBV复制的小鼠模型。在终止CsA处理后2周后分别给予小鼠PBS、重组乙肝疫苗、未免疫小鼠脾细胞过继免疫和特异性免疫小鼠脾细胞过继免疫处理，探讨免疫调节对免疫抑制状态下HBV持续复制的影响。 结果 1、将质粒pAAV/HBV1.2通过尾静脉高压水注射到BALB/c小鼠体内，能使小鼠产生较高的抗原血症和病毒血症。NS处理组7周内HBsAg被清除。CsA处理组在CsA处理期间抗原血症和病毒血症均维持在较高的水平。用CsA处理11周（-1至10周），能使75%的动物HBsAg的持续阳性超过6个月。 2、随着CsA处理时间的延长，小鼠HBsAg的表达持续时间也相应延长。CsA处理7周（-1至6周），能使大部分动物HBsAg持续阳性达6个月以上。 3、CsA持续处理不能抑制小鼠特异性T细胞的产生。相反，CsA处理组特异性T细胞反应较NS处理组明显增强。 4、CsA处理能抑制某些CD分子和细胞因子在肝组织和脾组织内的表达，包括CD3、CD4、CD8、FasL、Perforin、IL-2。但是对IFN-γ、TNF-α和IFN-β的表达却没有影响。CsA短期处理后，HBV感染清除，部分细胞因子的表达呈反弹上升趋势。 5、停止CsA处理的慢性HBV复制小鼠中，重组乙肝疫苗治疗能促进HBV的清除，并促进HBsAb和HBcAb的产生，增强小鼠特异性T细胞应答。 6、停止CsA处理的慢性HBV复制小鼠中，特异性免疫小鼠脾细胞过继免疫和未免疫小鼠脾细胞过继免疫均能控制HBV的复制，其中特异性免疫小鼠脾细胞过继免疫的作用尤为明显，并能促进HBcAb的产生和增强小鼠特异性T细胞应答。 结论 1、在高压水注射小鼠模型中，用CsA处理BALB/c小鼠能改变HBV复制持续的时间。CsA持续处理7周（-1至6周）可有效延长HBV的复制时间至6个月以上。 2、CsA处理对特异性T细胞的产生，以及相应细胞IFN-γ和TNF-α的表达和分泌无明细影响，但是对Perforin和Fas-L等免疫分子表达有抑制作用，与HBV的持续复制有关。这提示HBV的清除需要机体具备完整的免疫功能，功能缺失的特异性T细胞不足以清除HBV感染。 3、随着CsA处理的终止，CsA短期处理的小鼠体内HBV的复制可被清除，，肝内和脾内多种CD分子和细胞因子的表达水平反弹上升，特异性T细胞分泌IFN-γ的能力也增强，提示短期免疫抑制剂处理后机体的免疫功能可逐渐恢复并控制HBV的复制。 4、在停止CsA处理的HBV持续性复制小鼠中，重组乙肝疫苗免疫或特异性脾细胞过继免疫能有效清除或控制HBV的复制，促进小鼠体液免疫应答的恢复，增强特异性T细胞免疫应答。 本研究的创新点 1、以高压水注射的急性HBV复制小鼠模型为背景，利用免疫抑制剂处理BALB/c小鼠，导致HBV的持续复制。并初步阐述了CsA对宿主免疫功能的抑制作用，以及对延长HBV复制的可能免疫学机制。 2、利用CsA处理的HBV持续性复制小鼠模型，探讨免疫调节治疗在控制HBV感染中的作用。重组乙肝疫苗主动免疫或特异性脾细胞过继免疫能清除后有效控制HBV的复制，促进体液免疫应答的恢复，并促进特异性T细胞应答的增强，提示免疫调节可用于治疗免疫抑制剂诱导的慢性HBV感染。 本研究的意义 通过免疫抑制剂CsA调控小鼠的免疫功能，延长HBV在BALB/c小鼠中的复制，并研究CsA处理对机体免疫功能的影响，为理解免疫抑制状态下慢性HBV感染的免疫学机制提供新的见解。另外，利用主动免疫或被动免疫治疗慢性HBV复制小鼠，研究免疫调节对免疫抑制状态下HBV持续复制的影响，为免疫调节用于治疗免疫抑制剂诱导的慢性HBV感染奠定了实验和理论基础。
[Abstract]:Purpose 1. The BALB/ c mice were treated with immunosuppressive agents to inhibit the immunity of mice. Function. The plasmid pAAV/ HBV1.2 was injected with high-pressure water at the tail vein in these animals, and the virus, antigen and antibody responses of the mice were monitored, and the replication process of HBV was discussed. The effects of different treatment times on viral replication and antigen expression of HBV-replicating mice were observed. A BALB/ c mouse model for chronic HBV replication was established by long-term treatment of HBV, and the mice with chronic HBV replication were immunized with active immunization and passive immunization respectively after stopping the anti-inflammatory treatment, and the immune regulation was discussed. V Continuous Replication Effects of materials and methods 1, 6-8 weeks old female BALB/ c BALB/ c mice were treated with NS or OVA, and plasmid pAAV/ HBV1.2 was used to treat BALB/ c mice. Mice were injected to establish the mouse model of HBV replication. The blood samples of mice were collected on a regular basis. ECLIA was used to detect the levels of HBsAg, cryAb and cryAb in serum, and the HBV DNA, Real-Time PCR detects the degree of virus drop in the serum. 3. BALB/ c mice were divided into three groups: short-term treatment (-1 to 4 weeks), continuous treatment (-1 to 10 weeks) and saline treatment group, blood samples were collected at different time points or mice were killed, and the spleen of mice was tested by Elispoot. Detection of CD in Mouse Liver Tissues and Splenic Tissues by Real-Time PCR mRNA levels of molecular and antiviral-related cytokines. South Modern Blot tests the replication intermediates of HBV in the liver. Immunohistochemical method was used to detect the level of Ag in liver tissue. The immunological mechanism for prolonging the replication of HBV was analyzed. 4. BALB/ c mice (-1 to 10 weeks) were treated with MEBO. The plasmid was injected with high pressure water at the tail vein of 0 week. pAAV/ HBV1.2 was used to establish the mouse model of HBV replication. After 2 weeks after the end-of-day treatment, mice were treated with PBS, recombinant hepatitis B and non-immunized mouse spleen cells. to get rid of Effect of epidemic regulation on the continuous replication of HBV in immunosuppressed state. Results 1. Plasmid pAAV/ HBV1.2 was injected through tail vein high pressure water. In BALB/ c mice, mice can be produced Higher antigen and viremia. HBsAg was cleared within 7 weeks of the NS treatment group. The treatment group maintained high levels of antigen and viremia during the treatment period. Treatment with palbociclib for 11 weeks (-1 up to 10 weeks), 75% of animal HBsAg can be continuously positive for more than 6 months. With the prolongation of treatment time, the duration of HBsAg expression in mice was prolonged. 7 weeks (-1 to 6 weeks) enabling most of the animals to remain positive for HBsAg Sex for more than 6 months. 3. Continuous treatment cannot inhibit mouse specificity. In contrast, the specific T-cell response in the treated group was significantly higher than that in the NS treatment group. 4. The treatment of T cells inhibited some CD molecules and cytokines in liver and spleen groups. Expression in tissue, including CD3, CD4, CD8, FasL, Perf The expression of orin, IL-2. However, the expression of IFN-jun, TNF-jun and IFN-jun was There was no effect. After short-term treatment, HBV infection was cleared, and some cytokines expression showed a rebound trend. Therapy can promote the clearance of HBV, promote the production of anti-HBV Ab and anti-HBV Ab, enhance the specific T cell response of mice. 6. Stop the treatment of chronic HBV replication in mice, and specifically immunize the spleen cells of the mice. The adoptive immunotherapy of spleen cells of epidemic mice can control the replication of HBV, in which specificity immunity The effect of adoptive immunotherapy on spleen cells in mice is especially obvious, and it can promote the production and enhancement of mouse-specific T cell response. Conclusion 1. BALB/ c mice were treated with MEBO in the model of high pressure water injection. Mice can change HBV replication duration. Continuous treatment for 7 weeks (-1 to 6 weeks) can effectively prolong the replication time of HBV to more than 6 months. There was no detail effect on the expression and secretion of the expression and secretion, but it inhibited the expression of the immune molecules such as Perforin and Fas-L. V is related to continuous replication. This suggests that HBV clearance requires a complete immune function, and the absence of specific T cells is not sufficient to clear the HBV infection. The replication of HBV can be cleared, and the expression level of various CD molecules and cytokines in the liver and spleen rebound. It is suggested that the immune function of the body can gradually recover and control the replication of HBV after the short-term immune inhibitor is treated. group immunity or the adoptive immunotherapy of specific spleen cells can effectively eliminate or control HBV replication, promote the recovery of humoral immune response in mice and enhance the immune response of specific T cells. At the innovation point 1 of the study, the model of acute HBV replication with high pressure water injection was used as the background, and the immune response was used as the background. The inhibitor treated BALB/ c mice, leading to the continuous replication of HBV. Role and possible immunological mechanisms to prolong the replication of HBV. The model of HBV sustained replication in mice was used to explore the role of immunomodulating therapy in controlling HBV infection. can be effective after being cleared To control the replication of HBV, to promote the recovery of humoral immune response, and to promote the enhancement of specific T cell response. It is suggested that immunoregulation can be used to treat the chronic HBV infection induced by immunosuppressive agents. The immune function of mice is prolonged, the replication of HBV in BALB/ c mice is prolonged, and the effect of treatment on the immune function of the body is studied. In order to understand the immune mechanism of chronic HBV infection in immunosuppressed state, new insights are provided.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62;R392

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本文编号：2257912