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Cdc42在甲型流感病毒NA蛋白修饰及转运中的作用

发布时间:2018-10-16 13:01
【摘要】:流感病毒神经氨酸酶(NA)具有酶活性,对病毒入侵和释放起重要作用。依据其特性,NA成为研究设计抗流感病毒药物最适合的靶点。目前,虽然有研究不断地对NA抑制剂进行改进,但是流感病毒株对这些药物依然迅速产生耐药性。因此,开发新的抗流感药物和找到新的作用靶点迫在眉睫。在宿主细胞中,很多宿主蛋白对流感病毒的复制过程都有重要影响。其中小分子G蛋白RhoGTPases三个重要的家族成员Cdc42、RhoA和Rac1作为分子开关,涉及多种细胞信号转导途径,参与多种细胞生物活动。而且越来越多的研究表明,它们参与胞内运输的调控。但是它们是否对NA蛋白胞内转运起作用,它们中究竟是哪个蛋白起作用还没有相关报道。本文对这一问题进行了研究。 我们首先通过观察NA和NA(H274Y)突变体表达蛋白在细胞中定位的改变和检测NA(H274Y)突变体表面酶活的降低,建立起NA蛋白胞内转运研究体系。然后,用药物Toxin B处理转染NA的细胞,证实了Rho GTPases家族成员(Cdc42、 RhoA和Rac1)对NA蛋白胞内转运起促进作用。随后我们分别对Cdc42、RhoA和Rac1及它们相关持续活化和阻抑的突变体与NA蛋白的共定位进行观察,以及药物C3Transferase处理实验,证实是Cdc42起到促进作用。我们外源转入Cdc42一个特定的GTP酶活化蛋白(GAP)-ARHGAP21,抑制宿主细胞中Cdc42的活性,进一步证实内源Cdc42所起到的促进作用。 我们又对Cdc42与NA蛋白的作用方式进行了探究。GST-pulldown试验表明可能Cdc42与NA之间并不存在直接的相互作用。用TGN和GM130分别标记高尔基体,Confocal试验表明Cdc42影响了NA蛋白从高尔基体向胞质及胞膜的转运过程。随后的Cytochalasin D处理试验,揭示Cdc42通过对肌动蛋白的调控而影响NA蛋白的转运。 此外,我们还针对NA信号肽区域,构建了一系列的NA缺失突变体。我们发现,当NA跨膜区缺失10个以上氨基酸时,会导致NA蛋白不表达。我们对NA缺失11氨基酸的突变体进行了蛋白转运的研究,结果表明在细胞内的定位并未发生变化。 上述研究结果表明,Cdc42在甲型流感病毒NA蛋白修饰及转运中起到明显的促进作用。其中Cdc42在NA蛋白转运中的作用机制仍需进一步深入研究。
[Abstract]:Influenza virus neuraminidase (NA) has enzyme activity and plays an important role in virus invasion and release. According to its characteristics, NA has become the most suitable target for the design of anti-influenza drugs. At present, although studies continue to improve the NA inhibitors, influenza virus strains are still rapidly developing drug resistance to these drugs. Therefore, it is urgent to develop new anti-influenza drugs and find new targets. In host cells, many host proteins play an important role in the replication of influenza viruses. Among them, Cdc42,RhoA and Rac1, three important family members of small G protein RhoGTPases, are involved in many cell signal transduction pathways and participate in many cellular biological activities as molecular switches. More and more studies show that they are involved in the regulation of intracellular transport. However, whether they play a role in intracellular transport of NA protein and which of them is involved has not been reported. This paper studies this problem. We first observed the localization of NA and NA (H274Y) mutants in cells and detected the decrease of surface enzyme activity of NA (H274Y) mutants, and established a system of intracellular transport of NA proteins. Then, the cells transfected with NA were treated with Toxin B, which confirmed that Rho GTPases family members (Cdc42, RhoA and Rac1) promoted the intracellular transport of NA protein. Then we observed the co-localization of Cdc42,RhoA and Rac1 and their continuous activation and inhibition with NA protein, as well as the drug C3Transferase treatment. It was proved that Cdc42 played a promoting role. Our exogenous transfer into Cdc42, a specific GTP activator protein, (GAP)-ARHGAP21, inhibited the activity of Cdc42 in host cells, further confirming the role of endogenous Cdc42. We also studied the interaction between Cdc42 and NA protein. GST-pulldown test showed that there was no direct interaction between Cdc42 and NA. TGN and GM130 were used to label Golgi body respectively. Confocal test showed that Cdc42 affected the transport of NA protein from Golgi body to cytoplasm and cell membrane. Subsequently, the Cytochalasin D treatment test revealed that Cdc42 affected the transport of NA protein through the regulation of actin. In addition, we constructed a series of NA deletion mutants for NA signal peptide region. We found that the absence of more than 10 amino acids in the transmembrane region of NA resulted in no expression of NA protein. We studied the protein transport of the mutant with NA deletion of 11 amino acid. The results showed that the localization in the cell had not changed. These results suggest that Cdc42 plays an important role in the modification and transport of NA protein of influenza A virus. The mechanism of Cdc42 in NA protein transport needs further study.
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R373.13

【共引文献】

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本文编号:2274442

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