过表达结核分枝杆菌HspX蛋白的重组卡介苗的保护效应

发布时间：2018-10-17 12:13

【摘要】：背景与目的 Ag85B蛋白是结核分枝杆菌(M. tb)对数生长期分泌的保护性抗原,过表达Ag85B的重组卡介苗(rBCG)可以诱导比卡介苗(BCG)更强的抗M. tb保护效应,并已在国外完成I期临床试验。HspX蛋白是M. tb在体外稳定期或体内休眠状态表达的优势蛋白;在氧耗尽或感染巨噬细胞后,BCG只表达微量的HspX。HspX蛋白能诱导M. tb感染者机体产生强烈的Th1型免疫应答。BCG免疫后,可以诱导机体产生针对M. tb对数生长期分泌的保护性抗原的Th1应答,但不会引起针对HspX特异性的IFN-γ免疫反应。尚不清楚HspX蛋白能否用于研制rBCG。我们鉴定了过表达HspX蛋白的rBCG菌株(rBCG::X)、过表达Ag85B蛋白的rBCG菌株(rBCG::85B)和含有空载体pMV261的rBCG菌株(rBCG::261)等三个重组疫苗,将这些疫苗免疫小鼠,评价了它们的免疫原性和免疫保护性。 方法 1.在NCBI网站用BLASTn分析方法对M. tb的hspX基因序列进行生物信息学分析; 2. IPTG诱导重组蛋白Ag85B和HspX的原核表达,并进行纯化和鉴定,纯化蛋白用于疫苗的免疫原性分析; 3.对rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261进行传代培养,利用Western blotting鉴定这三个重组菌株的培养上清和菌体裂解液,分析Ag85B和HspX蛋白表达情况和稳定性; 4.将rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分别免疫C57BL/6小鼠,免疫后6周和24周,分别用ELISA检测小鼠抗原特异性IgG抗体和用ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌抗原特异性IFN-γ水平; 5.将rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,小鼠免疫6周后,进行M. tb H37Rv毒株攻击感染,感染4周后,分别检测小鼠脾脏和肺脏的荷菌量以及肺脏病理改变,比较评价重组疫苗对不同种属小鼠的保护性。攻击感染18周后,分别检测C57BL/6小鼠脾脏和肺脏的荷菌量以及肺脏病理改变,比较评价重组疫苗对C57BL/6小鼠的短期和长期保护性。 结果 1. hspX基因生物信息学分析显示,与M. tb H37Rv菌株的hspX基因核苷酸序列一致性达100%的有7株细菌,均属于M. tb复合体和BCG,包括一株MDR-TB菌株; 2.重组蛋白HspX和Ag85B原核表达纯化过程的SDS-PAGE和纯化蛋白的Western blotting,证实纯化蛋白具有较高的纯度和蛋白活性; 3.重组疫苗的培养上清和菌体裂解液的Western blotting显示,rBCG::X在菌体裂解液中表达较高水平的HspX,培养上清中则有较高水平的Ag85B,且表达是稳定的; 4. rBCG免疫C57BL/6小鼠后,能够诱导产生抗原特异性的体液和细胞免疫应答。血清IgG抗体ELISA检测显示,与rBCG::261免疫小鼠比较,rBCG::X免疫小鼠产生较高水平的HspX和Ag85B抗原特异性IgG抗体(p 0.05)。IFN-γELISPOT检测显示,rBCG::X实验组在免疫后6周和24周,HspX和Ag85B蛋白特异性的分泌IFN-γ的细胞数比rBCG::261实验组高(p 0.05); 5.在攻击感染后4周和18周的荷菌量分析显示,与rBCG::261免疫小鼠相比,rBCG::X免疫小鼠在抵抗M. tb感染时产生更加持久的保护效应,肺脏的荷菌量更少(p 0.05),病理变化更轻微。比较rBCG::X和rBCG::85B疫苗的保护效应,rBCG::X免疫小鼠肺脏的荷菌量有轻度显著下降(p 0.05)。 结论 1. rBCG::X引起更高更持久的保护性可能与以下原因有关:过表达HspX蛋白可能使rBCG::X形成更厚的细胞壁,在体内持留时间延长;过表达的HspX和Ag85B,使这两个抗原特异性IFN-γ显著增加,从而使rBCG::X保护性显著增强; 2.我们的结果证实,HspX蛋白作为BCG免疫人群和潜伏感染(LTBI)人群诱导差异免疫反应的抗原,发展rBCG可以提高BCG的保护性。表明在抗结核病(TB)的疫苗研究中,这些差异免疫反应抗原如M. tb潜伏感染抗原具有良好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：2276620