日本血吸虫鞘脂激活蛋白原T细胞免疫原性及功能研究

发布时间：2018-10-18 10:30

【摘要】：日本血吸虫病仍然是在我国南方流行的一种人兽共患病。长期血防实践证明,要控制血吸虫病的流行,有必要采用高效安全的抗血吸虫病的分子疫苗。因此,怎样合理高效地筛选和鉴定抗血吸虫的保护性分子一直是个热点和难点课题。选择血吸虫体表相关分子,评价它们是否能够模拟辐照致弱RA尾蚴疫苗的保护性效应机制,可能是个值得探索的方向。本课题组陈雷等前期的初步研究发现:预测的含有信号肽的日本血吸虫鞘脂激活蛋白原(SjPSAP)分子可能存在于虫体的体被膜上,来源于SjPSAP分子中的一个肽序列可能是个潜在的T细胞表位,推测它可能是个新的抗血吸虫的保护性候选抗原分子。因此,本研究进一步评价了SjPSAP分子的免疫生物学功能,旨在为高效合理发现抗血吸虫的保护性抗原提供基础。 首先,应用分子生物学技术克隆和表达SjPSAP分子,分析了该分子的免疫原性,观察了SjPSAP分子在不同期别虫体中的组织定位。结果成功克隆和表达了分子量为106kDa的重组蛋白(rSjPSAP);Westen Bloting分析显示,该重组蛋白可被其免疫小鼠血清和感染日本血吸虫的小鼠阳性血清所识别,并且重组蛋白免疫鼠血清还可以识别7d、14d、23d、32d和42d的血吸虫虫体蛋白;免疫荧光检测到在日本血吸虫7d、14d、23d、32d和42d的虫体体被的表膜均可见绿色荧光信号。说明rSjPSAP具有一定的抗原性,该分子可以定位于血吸虫的体表膜部位。 为评价SjPSAP分子是否具有模拟血吸虫RA疫苗诱导宿主产生以Th1类CD4+T细胞介导的保护性效应功能,对该分子中可能存在的Th细胞表位进行了筛选和鉴定。首先是应用SYFPEITHI,MHCPred,HLAPRED以及ClusPro等在线服务器筛选出得到了可能与宿主MHCII类分子结合的11条肽;然后用人工合成的预测肽免疫小鼠,用改进的MTT法体外检测发现预测肽中有5条肽(p75-89,p402-416,p904-918,p93-107,p16-30)能够明显刺激免疫鼠脾淋巴细胞的增殖(刺激指数SI值大于2,且它们的SI值与对照组的比较存在显著差异,P0.05);ELISA法检测结果有6条预测肽(p75-89,p809-823,p490-504,p904-918,p93-107,p16-30)以及阳性对照肽在刺激后,脾细胞分泌至上清中的IFN-γ量显著增加;免疫鼠CD4+T细胞内细胞因子的分泌图式测定显示,p75-89,p402-416,p904-918,p93-107,p16-30肽体外刺激免疫鼠脾淋巴细胞后,分泌Th1细胞因子IFN-γ的CD4+T细胞的比例要高于分泌Th2细胞因子IL-4的CD4+T细胞的比例;流式细胞术检测体外直接结合鼠脾细胞实验结果表明,62.62% 90.38%的细胞被生物素化的预测肽标记上,用竞争性未标记肽检测显示对标记肽的结合抑制率在67.94%-90.78%之间,用抗I-Ad和抗I-Ed的抗体竞争孵育检测,结果抑制率分别为57.61% 88.79%和35.55% 77.05%。说明SjPSAP分子中可能含有4个Th1细胞表位肽,这些肽表位都可以很好地与小鼠抗原递呈细胞直接结合。 选用rSjPSAP和6个预测肽(包括上述已鉴定的4个潜在的Th1细胞表位肽和另外2个肽p809-823, p856-870),在BALB/c小鼠模型中进行了抗血吸虫的免疫保护实验。结果显示,rSjPSAP免疫诱导了40.57%和41.54%(P0.05)的减虫率、40.39%和43.30%的肝组织减卵率;4个Th1表位肽免疫分别诱导了26.37%～28.75%和26.25%～28.69%的减虫率、22.85%～29.61%和25.96%～30.90%的肝组织减卵率;另外2个肽(p809-823, p856-870)免疫则分别诱导了16.87%～18.57%和20%～20.81%的减虫率、15.59%～20.17%和16.27%～20.72%的肝组织减卵率。rSjPSAP免疫后小鼠血清特异性抗体亚型IgG2a/IgG1的比值呈上升趋势;4个Th1表位肽免疫小鼠血清IgG2a/IgG1的比值则呈现不同的变化趋势;而另外2个肽免疫小鼠血清IgG1/IgG2a的比值变化趋势不大。说明rSjPSAP及其所含的4个Th1细胞表位肽都具有一定的抗血吸虫的保护性效果,且rSjPSAP的效果可能与其诱导的Th1细胞介导的免疫相关。 总之,本研究鉴定了SjPSAP蛋白分布于虫体的体被膜中,可能含4个潜在的Th1细胞表位,rSjPSAP及其表位肽免疫小鼠具有一定的抗血吸虫的效果;为进一步高效合理地发现抗血吸虫的保护性T细胞抗原或表位提供了一定的理论和实验依据。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2278856