Sonic hedgehog对血管平滑肌细胞迁移和自噬的调控作用和机理研究

发布时间：2018-10-18 11:14

【摘要】：背景：心血管疾病是危害人类健康的一种常见疾病。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作为血管壁中层的重要的细胞组成部分，其分化、增殖、迁移和自噬在心血管疾病的发生、发展过程中起着重要作用。一般认为，低分化程度的VSMC是血管平滑肌参与心血管疾病发生、发展的基础，这一过程同时伴随着VSMC细胞增殖和迁移能力的增强。细胞自噬过程是一种细。胞内细胞器、细胞质等的亚细胞结构降解途径，在真核细胞中高度保守。大量研究表明细胞自噬参与了心血管系统的发育和发病过程，具有非常重要的作用。Sonic hedgehog（Shh），一个重要发育相关的有丝分裂素和形态发生素，参与了多个器官、组织的发育过程，并能在病理条件刺激下从静止状态转化为激活状态，在多种细胞的分化、增殖和迁移过程中起着重要作用。在发育过程中，阻断或者异常激活Shh信号通路均会导致心血管系统的发育异常；在心梗患者中， Shh信号通路的激活显著促进了缺血部位血管新生的过程；病理情况下，Shh信号通路的阻断，虽然降低了血脂中氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow-density lipoprotein，ox-LDL）的水平，却导致动脉粥样硬化斑块体积的增大，但是具体的机制还有待研究。目的：本文通过探究Shh如何影响VSMC分化、增殖、迁移和自噬过程，深入探究相关分子机制，从而为发展Shh作为治疗心血管疾病如动脉粥样硬化的潜在功能分子提供了理论依据。方法： 1应用C57BL/6J小鼠颈动脉结扎新生内膜模型，并借助于药物载体PluronicF-127凝胶分别给于不同的处理，包括Shh信号通路抑制剂环王巴明（cyclopamine）、自噬抑制剂3-Methyladenine (3-MA)和AKT通路抑制剂四（AKTI IV）。分离不同处理的结扎部位颈动脉组织，HE染色鉴定新生内膜增生情况；Western blotting方法检测Shh和自噬标志物微管相关蛋白轻链3-II（microtubule-associated protein1light chain3-II，LC3-II）、迁移相关分子基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的表达差异。 2应用转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激体外培养的VSMC，建立VSMC体外分化模型。以外源重组Shh、Shh信号通路激动剂SAG处理的VSMC和四环素诱导表达系统（tetracycline-regulatedexpression， T-Rex）诱导表达小鼠Shh基因的人细胞系为研究对象，应用实时定量PCR（Real-time PolymeRase chain reaction，RT-qPCR）、Western blotting方法，检测Shh信号通路激活对VSMC收缩表型标志物平滑肌α-肌动蛋白（smoothmuscle α-actin，SM α-actin）、肌动蛋白相关蛋白SM22（smooth muscle22，SM22）、myocardin表达的影响；应用WST-1和bromodeoxyuridine(BrdU)掺入、流式细胞术等方法检测Shh信号通路激活对TGF-β1抑制的细胞增殖的影响。 3应用Trans-well和划痕实验(Wound healing)检测了Shh信号通路激活对VSMC迁移和浸润的影响，并通过Western blotting、实时定量PCR和明胶酶谱法等实验方法，检测MMP-2和MMP-9的表达变化和活性变化情况，进一步通过丝裂元活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，，MAPK)信号通路抑制剂PD98059和蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB/AKT)信号通路抑制剂AKTI IV探讨MAPK和AKT信号通路在这一现象中扮演的角色。 4应用实时定量PCR、Western blotting、免疫荧光、扫描电子显微镜、自噬相关基因7（autophagy-related gene7，ATG7） siRNA基因沉默技术等方法，检测Shh信号通路激活或抑制对自噬标志物LC3-II的表达变化情况，进一步通过哺乳动物Rapamycin靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)通路抑制剂雷帕霉素（rapamycin）和AKTI IV探讨mTOR和AKT信号通路这一现象中扮演的角色。结果： 1C57BL/6J小鼠颈总动脉结扎新生内膜模型结果显示，相较于未结扎组织，小鼠颈总动脉结扎部位的Shh和LC3-II表达显著上调，而3-MA、AKTI IV和cyclopamine均显著抑制颈总动脉新生内膜的增生，同时cyclopamine抑制了新生内膜中LC3-II、MMP-2和MMP-9的表达； 2Shh信号通路的激活显著抑制TGF-β1诱导的VSMC收缩表型标志物SM-αactin、SM22和myocardin的表达，并且促进VSMC合成表型标志物骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达。Shh信号通路的激活显著逆转TGF-β1所抑制的VSMC的增殖； 3Shh信号通路激活显著促进VSMC迁移和浸润，促进了VSMC中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和活性的提高，同时激活了p42/44和AKT的磷酸化，相反，Shh信号通路抑制剂cyclopamine、MAPK通路抑制剂PD98059和AKT通路抑制剂AKTI IV显著抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和活性。 4Shh信号通路的激活显著促进VSMC自噬。Shh信号通路激活促进自噬小体的数目明显增多，上调了自噬标志物LC3-II的表达，同时激活了p70S6K和4E-BP1的磷酸化。自噬小体与溶酶体结合抑制剂bafilomycin A1和蛋白酶抑制剂E64D、pepstainA通过抑制LC3-II在溶酶体中的降解增加了LC3-II的表达，cyclopamine和ATG7siRNA降低了LC3-II的表达，mTOR通路抑制剂rapamycin抑制了Shh诱导的p70S6K和4E-BP1的磷酸化，却协同促进了shh诱导的LC3-II的增加。AKTI IV抑制了Shh诱导的AKT的磷酸化，同时抑制了Shh诱导的LC3-II的表达和自噬小体的数目的增多。另外，Shh所诱导的VSMC自噬有利于细胞存活，而3-MA、bafilomycinA1、cyclopamine、AKTI IV和ATG7siRNA均抑制了这一过程。结论： 1Shh抑制了TGF-β1所诱导的VSMC分化，削弱了TGF-β1所诱导的VSMC增殖； 2Shh通过MAPK、AKT信号通路激活依赖的方式促进了基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和活性的增强，从而促进了VSMC的迁移和浸润过程； 3Shh通过mTOR信号通路非依赖而AKT信号通路依赖的方式促进了VSMC的自噬过程，促进了自噬小体的形成和自噬标志物LC3-II的表达，这一自噬过程有利VSMC的存活。以上结论为发展Shh作为治疗心血管疾病的潜在功能分子提供了理论依据。细胞因子信号抑制子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一个负调控细胞因子信号转导的蛋白家族，通过多种方式抑制JAK/STAT(janus kinase/signaltransduction and activators of transcription)信号途径。SOCS3是SOCS家族的重要成员，是一个重要的细胞因子抑制子。我们通过生物信息学方法分析了小鼠SOCS3蛋白的一级结构、二级结构、三级结构，并结合序列同源性分析和Motif搜索方法对SOCS3蛋白进行了功能区预测，最后根据预测结果成功构建了缺失预测的功能区的SOCS3基因克隆，进一步观察了转染后其对小鼠骨髓细胞（bonemarrow cells，BMC）分化的影响。结果表明缺失脯氨酸富集区的SOCS3失去了促进骨髓细胞分化成CD8+T细胞的生物学功能，一定程度上证明了SOCS3的脯氨酸富集区是SOCS3发挥正常功能的一个不可缺失的重要功能区。
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【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R3411

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