利用Gateway技术构建组织特异启动子及在诱导型多能干细胞分化研究中的应用

发布时间：2018-10-18 17:22

【摘要】：胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚的一种多潜能细胞[1]，能在体外自我更新，在适当的条件下可以分化为成体的各种类型的组织细胞[2]，是当前生物学研究的热点，在发育生物学、遗传学、毒理学和药物筛选研究等领域中发挥着日益重要的作用[3]。2007年底，日本和美国两个科研小组应用病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4[4]（或者是Nanog和Lin28[5]）四个基因转导至人的成纤维细胞，使其逆向分化为具有胚胎干细胞特性的多潜能干细胞，即为诱导的多潜能干细胞（iPSCs细胞，induced pluripotent stemcells）[6-8]。iPSCs细胞具有和胚胎干细胞类似的生物学特性，通过这个技术建立病人特异的胚胎干细胞系，可以彻底的解决细胞治疗中的免疫排斥问题，而且绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，为疾病发生发展的机理研究、疾病特异性药物的筛选和细胞移植治疗提供了很好的研究模型。胚胎干细胞以无限增殖能力和全能性等优点，为组织工程种子细胞的重要潜在来源[5]。α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)是细胞内六种肌动蛋白亚类之一，在所有真核细胞中的表达都高度保守[6]。编码它的基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一，公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志[7]。大量的实验证明胚胎干细胞可以特异分化三胚层的细胞类型，为将来的细胞替代治疗带来了希望。然而，目前的胚胎干细胞分化研究都存在一个问题：难于纯化目标细胞群。解决的方法主要有以下两种，例如使用目的细胞特异抗体标记的方法，或者构建组织细胞特异启动子携带报告基因的载体转染细胞（分化以后所得到的目的细胞会带有报告基因），最终都可以通过流式细胞分选技术收集目的细胞。后者较前者还具有优势，就是将携带报告基因的细胞移植到体内后，能够方便的观察细胞在体内的迁移、分化以及对移植效率进行有效的评估，为移植治疗的研究提供了有力的工具，同时利用这种细胞可以进行体外的药理、毒理和化学生物学等方面的研究。转基因就是将外源基因导入生物体或者细胞内，使宿主的遗传性状发生改变。通过转基因技术使干细胞携带标记基因，可以在体内实验中作为示踪剂对移植的细胞进行跟踪；体外实验中，标记基因便于干细胞的观察。鉴于胚胎干细胞和转基因技术的重要性，因此，如何能将外源基因高效地转入胚胎干细胞并能在不影响其生物学特性的情况下持续稳定表达就显得十分必要。目前，胚胎干细胞的转基因方法有很多种[9]，包括物理方法（如电穿孔[10]）、化学方法（如Lipofectamine2000[11]）和病毒转导[12]等三大类。由于胚胎干细胞呈克隆状生长，生长环境比较复杂，通过传统的转基因方法很难获得表达外源基因的均一性细胞群体，较理想的方法多是通过慢病毒载体介导而完成的。传统的慢病毒质粒构建技术需要进行酶切、连接等过程，操作繁琐复杂。近年来有科学家建立了一种更为灵活通用的克隆方法—Gateway技术，Gateway技术是利用λ噬菌体特异性结合位点，在Clonase的作用下整合到宿主E.coli的基因组中的一种新的通用型克隆技术[13]。利用Gateway技术构建慢病毒载体,只需要在目的基因两端加上特异性的15bp大小的att结合位点,通过两种Clonase作用下的BP和LR结合反应,即可将目的基因导入载体中,其整合率可达到100%。而且去除了酶切、连接过程,可以避免假阳性的出现。因其操作方便,Gateway技术近年来在基因工程中的应用已越来越广泛[14]。有鉴于此，本实验的主要研究思路是，本研究先构建携带小鼠αSMA和αMHC基因启动子的报告基因载体，然后以人诱导型多能干细胞为模型，经诱导分化形成类胚体后，进一步添加报告基因载体，再特异性向平滑肌细胞分化，对所得到的荧光细胞进行鉴定和分析，并观察向平滑肌细胞的分化。因此，本研究主要分为以下两个部分：第一部分：利用多位点Gateway技术构建系列慢病毒载体。第二部分：携带组织特异启动子的慢病毒载体转导人诱导型多潜能细胞及其诱导分化的实验研究。第一部分利用多位点Gateway技术构建αSMA和αMHC基因启动子慢病毒载体 1.1目的利用Gateway技术构建αSMA和αMHC基因启动子慢病毒载体，将载体质粒线性化后瞬时转染C2C12细胞系，并且用免疫荧光染色检测基因的表达。目的在于通过操作简便的Gateway技术快速、高效的构建系列的慢病毒载体。 1.2方法 1.2.1利用Gateway技术中涉及到的LR结合反应，将入门克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1与目的载体2K7puro进行连接，构建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒。 1.2.2通过LR反应将pUp-αSMA和pDown-hrGFP(含att位点的hrGFP入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin，得到pLVpuro/α-SMA-hrGFP的表达载体；经PCR和测序鉴定，将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系，并且用免疫荧光染色检测基因的表达。 1.3结果 1.3.1将携带报告基因的入门克隆pDONRTM221-reporter gene和携带启动子的pDONRTML4-promoter-R1与目的载体2K7puro进行连接，成功构建pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表达载体，测序结果表明启动子序列正确，将表达载体转化入大肠杆菌后，得到单细菌克隆。 1.3.2将pLVpuro/αSMA-hrGFP gene的表达载体质粒线性化后瞬时转染C2C12细胞系，细胞48h至72h后，hrGFP报告基因和免疫荧光检测证实C2C12细胞内的荧光表达。 1.4结论 1.4.1成功构建αSMA以及αMHC基因启动子的2K7puro/promoter-reporter gene的慢病毒表达载体。 1.4.2pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表达载体质粒线性化后瞬时转染C2C12细胞系，细胞48h至72h后，证实构建的报告基因载体可以反映αSMA以及αMHC基因的表达情况。第二部分：携带组织特异启动子的慢病毒载体转导人诱导型多潜能细胞及其诱导分化的实验研究。 2.1目的用携带特异启动子的pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒载体转导人iPSCs细胞，转导后第7天开始使用嘌呤霉素筛选，即可获得携带载体质粒的纯化的人iPSCs细胞，然后加入诱导试剂促进人ES细胞向平滑肌分化，以获得表达αSMA的绿色荧光细胞，并进行相关的鉴定分析。 2.2方法 2.2.1FSK-iPSCs细胞生物学特性的分析：对iPSCs细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。 2.2.2利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒载体转导hrGFP进入iPSCs细胞 2.2.3抗生素筛选纯化转导后的FSK-iPSCs细胞 2.2.4转导pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs细胞体外分化约5天后，通过流式细胞仪分选其CD4阳性细胞后继续向血管平滑肌细胞定向诱导分化，并观察其荧光表达情况。 2.3结果 2.3.1FSK-iPSCs细胞生物学特性：iPS细胞表达Oct4、SSEA-1，，在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。 2.3.2包装pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒并转染成功，抗生素筛选后得到阳性细胞克隆。 2.3.3转导pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs体外分化后，通过流式细胞仪分选到CD4阳性细胞。 2.3.4分选到的CD4阳性细胞向血管平滑肌分化后，获得表达αSMA的绿色荧光细胞。 2.4结论 2.4.1FSK-iPSCs细胞具有与人ES细胞相似的生物学特性 2.4.1成功利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒慢病毒转导FSK-iPSCs细胞,转导后定向分化为血管平滑肌并表达αSMA，证实构建的报告基因载体可以反映αSMA的表达情况，为以后分化机理和移植治疗的研究提供了很好的工具。
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【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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