c-Abl通过磷酸化STAT1调控IFNγ应答途径

发布时间：2018-10-24 13:46

【摘要】：非受体酪氨酸激酶c-abl基因位于人的第9号染色体，是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在细胞内的同源基因，编码蛋白分子量约为140kDa。c-Abl定位于多种亚细胞结构中，能够被多种应激信号活化，通过其酪氨酸激酶活性参与调控细胞增殖、骨架重塑、细胞黏附、氧化和DNA损伤应激、细胞凋亡、细胞转化以及细胞迁移等生命活动，发挥重要的生理功能[1]。研究表明，c-Abl与机体的免疫调节密切相关[2-5]。c-abl敲除小鼠多效性表型为围产期死亡率高、病原体易感性增强、免疫系统缺陷，，如胸腺和脾变小，T、B淋巴细胞发育严重受损[2]。c-Abl还参与TCR和BCR依赖的信号转导通路，c-Abl缺陷会导致TCR信号诱导、增殖、细胞因子分泌功能减弱[5]；B淋巴细胞表面分子CD19是c-Abl的激酶底物[6]。然而，目前c-Abl调控机体免疫系统发育和抗感染免疫应答的分子机制并不清楚。本实验室前期转录组数据显示，c-Abl缺陷细胞与野生型细胞相比，免疫蛋白酶体诱导亚基Mecl-1、调节亚基PA28α转录水平下调。免疫蛋白酶体在适应性免疫系统中具有非常重要的作用，主要由IFNγ诱导形成。IFNγ是唯一一种II型干扰素，主要由活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生，具有抗病毒、免疫监视、免疫调节及抗肿瘤等特性。IFNγ的生物学活性依赖于细胞内分子信号转导网络的激活，目前JAK-STAT信号转导通路最为广泛研究和认可[7,8]。首先IFNγ与细胞表面的IFNγ受体(IFNGR1和IFNGR2)相结合，使得胞内与IFNGR2相连JAK2激酶发生自磷酸化，激活的JAK2磷酸化JAK1激酶，接着JAK1磷酸化IFNGR1440位酪氨酸，使其产生STAT1蛋白的锚定位点，被募集的STAT1蛋白701位酪氨酸被磷酸化，目前认为可能[9]是被JAK2介导，同时STAT1Ser727在IFNγ信号转导中也会被磷酸化[10]，活化的STAT1蛋白形成同源二聚体，与受体解聚，进入细胞核内，结合含有gamma激活序列(GAS)的基因启动子[11]，启动IFNγ效应基因的表达，从而发挥其抗病毒生物学活性。本研究我们首先利用荧光定量PCR验证转录组数据，结果显示c-Abl敲低细胞中免疫蛋白酶体诱导亚基Lmp2和调节亚基PA28α的IFNγ诱导转录水平低于野生型细胞，并且抗原提呈相关转运体Tap1本底转录水平也出现下调。通过查阅文献发现，Lmp2和Tap1基因共用一个双向转录启动子，而且两个基因的转录均受到IFNγ调控[12]，因此我们构建Lmp2转录启动子荧光素酶报告系统，突变其中已知转录调控序列，结果显示，c-Abl是通过GAS序列调控Lmp2基因转录。GAS转录活性由IFNγ经典信号转导通路JAK-STAT1中的关键因子STAT1调控，因此，提示我们c-Abl可能通过调控STAT1蛋白影响IFNγ效应基因表达。利用免疫共沉淀方法证明细胞内源性和过表达c-Abl与STAT1能够形成免疫复合物，GST-pull down和Far Western结果表明c-Abl与STAT1是直接相互作用，而且c-Abl通过其SH2结构域与STAT1C端结合，利用细胞原位检测蛋白质相互作用的技术Duo-Link发现IFNγ能够增强c-Abl与STAT1的相互作用，并且具有IFNγ剂量依赖性。进一步研究发现，IFNγ诱导c-Abl缺陷细胞中STAT1已知关键氨基酸位点Tyr701和Ser727磷酸化水平显著弱于野生型细胞，这两个位点的磷酸化修饰对于STAT1蛋白的信号转导和转录激活活性至关重要；通过过表达和体外激酶分析证明c-Abl能够特异性磷酸化STAT1，并且质谱数据结果表明c-Abl介导STAT1Tyr701磷酸化；利用JAK2缺陷型细胞和JAK1/2激酶抑制剂证明c-Abl磷酸化STAT1不依赖于JAK激酶，并且c-Abl能够促进STAT1蛋白表达水平，调控其同源二聚体的形成及进入细胞核。实验最初已经证明了c-Abl调控IFNγ应答基因Lmp2和Tap1转录表达，为了更进一步说明c-Abl通过磷酸化STAT1影响IFNγ效应基因表达，同样应用定量PCR发现c-Abl缺陷细胞中IFNγ应答基因Ip10和Isg15转录水平下调；IFNγ诱导产生的免疫蛋白酶体和抗原提呈相关转运体TAP主要负责细胞内MHC-I类抗原的加工和提呈。研究表明，与普通蛋白酶体相比，免疫蛋白酶体更适合加工降解产生与MHC-I类分子相结合的抗原表位，抗原肽通过TAP提呈至MHC-I类分子并转运到细胞表面，激活CD8+T淋巴细胞，杀伤病原体感染的靶细胞，阻断病原体增殖[13]。通过抗原提呈试验发现，当c-Abl激酶活性受到抑制时，小鼠树突细胞JawsII的MHC-I类抗原提呈能力显著降低。在细胞水平上，我们证明c-Abl能够调控IFNγ诱导的抗病毒生物学活性以及病毒的增殖能力，对于野生型MEF细胞，随着IFNγ作用浓度的增加，诱导细胞产生抗VSV病毒能力也逐渐增强，而当c-Abl激酶活性受到抑制或被敲低后，IFNγ不能有效诱导细胞产生抗病毒活性；同时我们通过流式细胞术检测GFP荧光强度来评价NDV-GFP在细胞中的增殖能力，发现当c-Abl激酶活性受到抑制时，NDV-GFP在细胞中的增殖能力显著增强，而外源导入c-Abl表达质粒后能在一定程度上抑制病毒增殖。综上所述，本研究发现c-Abl能够特异性磷酸化STAT1，调控IFNγ效应基因表达及其抗病毒生物学活性，首次发现除JAK之外的非受体酪氨酸激酶c-Abl通过STAT1调控IFNγ信号转导，初步揭示了c-Abl参与调控机体免疫系统的分子机制，为IFNγ抗病毒信号转导途径作出重要补充。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【引证文献】