高效检测人降钙素原化学发光免疫分析方法的建立与评价

发布时间：2018-10-25 15:19

【摘要】：目的重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法。方法根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切将其构建到pET32a载体上;将pET32a-PCT质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用Western blot法分析重组蛋白表达情况;用镍亲和纯化柱纯化重组蛋白,以此为抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化后再用间接ELISA法筛选阳性单克隆细胞;将阳性单克隆细胞接种于小鼠腹腔内,制备腹水单抗,经Protein A/G纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,采用间接ELISA方法对抗体的特异性、灵敏度以及亲和力进行鉴定;用NaIO4氧化HRP法标记单克隆抗体,通过棋盘法筛选配对单克隆抗体,以筛选的配对抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心化学发光免疫分析的血清学检测体系,检测临床150例血清标本,其中PCT升高(0.05ng/ml)120例,PCT阴性(0.05ng/ml)30例。结果共筛选出6株抗人PCT蛋白的单克隆细胞,制备的腹水效价均大于4×10~(-6);通过棋盘法筛选得到2对能够进行双抗夹心配对的单抗,其中1对亲和力较高,其亲和力常数分别为2.39×10~8 L/mol和2.91×10~8 L/mol。双抗夹心化学发光免疫分析方法检测线性范围为0.06~8ng/ml,其中阳性检出率为96.6%,阴性符合率为100%,与临床检测数据相比,相关系数R~2=0.9737。结论建立的双抗夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠,可用于细菌、寄生虫等病原体感染患者的PCT血清学定量检测。
[Abstract]:Objective to express human procalcitonin (PCT) protein in prokaryotic expression and to prepare monoclonal antibody against human PCT and to establish an efficient chemiluminescence immunoassay for the detection of human calcitonin (PCT). Methods according to the sequence of PCT gene provided by NCBI, the whole gene was synthesized by optimizing the codon preference of Escherichia coli, and was constructed into pET32a vector by double digestion of BamH 鈪，

本文编号：2294075