NK细胞在抗结核分枝杆菌感染中的作用

发布时间：2018-10-29 08:13

【摘要】：研究背景：中性粒细胞（PMN）和自然杀伤细胞（NK）是重要的天然免疫细胞。天然免疫细胞在抗结核感染中受到更多关注，而PMN和NK细胞在结核感染中的作用却一直很少被注意到。近年来研究发现，PMN和NK细胞这一具有天然免疫作用的细胞可能也参与抗结核感染的免疫保护作用，但PMN在抗结核感染的免疫保护作用中的确切机制尚未明确。探讨PMN和NK细胞在抗结核感染的天然免疫作用的具体作用机理，以及与γδT细胞在抗结核感染中的相互调节作用,对全面了解结核病的发病机制和机体抗结核感染的免疫保护机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。目的：检测和比较初治和复治结核病患者与健康人外周血NK细胞的数量和胞内杀伤分子的变化。并且通过检测健康人和肺结核患者外周血NK细胞的细胞因子的表达，PMN细胞和γδT细胞共培养产生IL-17、IFN-γ的变化，探讨NK细胞，PMN细胞在结核感染中的作用和意义。方法：1.取健康人（112例）和结核病患者外周血145例（初治105例，复治40例）。抗凝外周全血标本，加荧光抗体CD3APC,CD56PE,CD8PECY5.5染色，溶血洗涤后在流式细胞仪检测。分析采用BD公司cellquest软件。在FSC-SSC点阵图上设定淋巴细胞R1，，再以R1设门（G1），在CD3和CD56点阵图上作四分法（Quadrants）划区，以CD3-CD56+区为NK细胞区，计算在淋巴细胞中的百分率。同时每份外周血标本在GT-1200全自动血液分析仪上以血常规分析方法对白细胞作三分类（即粒细胞，淋巴细胞，单核细胞）计数检测，获得淋巴细胞绝对数，再与流式检测的NK细胞的百分比相乘计算获得NK细胞的绝对数。 2.检测胞内杀伤分子的染色检查在表染后作固定透膜处理，再加抗颗粒溶解素，抗颗粒酶和抗穿孔素荧光抗体染色，透膜洗涤后再上流式仪检测分析。 3．采集22例活动性肺结核病人和18例HD外周血，加入佛波醇酯（PMA）和钙离子霉素（Ionomycin）刺激培养2小时后，再加入莫能霉素（Monensin）继续培养4小时，收集细胞，加入荧光标记抗体CD3APC,CD56PE进行表面分子染色，透膜后再加细胞因子荧光标记单抗抗IL-17IL-22和抗IFN-γ TNF-α作细胞内染色，流式细胞仪检测分泌IL-22IL-17和IFN-γ TNF-α的淋巴细胞亚群的比例。 4.取9例健康外周血各10ml采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），加入Mtb-HAg和rIL-2刺激培养7-10天后，使其成为富含效应性γδ T细胞的Mtb-HAg激活的T细胞（Mtb-AT），然后和PMN共培养24h，收集细胞用PMA/Ionomycin和Monensin以及Mtb-HAg和Monensin刺激培养6小时，用流式细胞仪检测γδ T分泌IL-17和IFN-γ的比例。 5.取10例健康外周血各10ml，分离获得PBMC,用含5%NBS培养液RPM11640配成细胞悬液浓度为1.5×106"ml，在24孔培养板上种5孔分别加入IL2、MTB-HAg、HDMAPP、MTB-HAg+IL2、HDMAPP+IL2处理，在0h，12h，36，48h，72h后染抗CD3-CD56+，然后检测各孔NK细胞的CD69，CD25的变化。结果: 1.初治肺结核患者外周血淋巴细胞中NK细胞的比例(16.95±8.27)%显著低于健康组(19.99±9.28)%和复治组(20.59±7.99)%。 2.健康人组（88例）外周血NK细胞绝对值计数为（44.32±26.69）×104"ml，结核初治组（90例）为（33.31±21.44）×104"ml，复治组（33例）为（36.8±24.97）×104"ml。结核初治组明显低于正常组（p＜0.05）。 3.结核病患者NK细胞中表达颗粒溶解素(85.78±11.63)%，穿孔素（82.88±17.05）%和颗粒酶（79.07±15.64）%和健康人组(87.31±10.34)%,(82.85±13.03)%和(88.04±7.27)%无明显差异。而结核病组CD8+T细胞中表达颗粒溶解素(28.42±16.27)%，颗粒酶（40.03±16.69）%，穿孔素（15.12±16.31）%和正常组差异不明显。 4.健康人外周血NK细胞中表达IL-17(21例)(1.41±1.42)%，IFN-γ(21例)(26.99±2.38)%，IL-22(21例)(0.51±0.36)%，TNF-α(11例)(2.29±1.77)%和肺结核患者外周血NK细胞中产生IL-17(22例)(2.78±2.65)%，IFN-γ(20例)(37.07±3.1)%，IL-22(18例)(1.61±1.46)%，TNF-α(15例)(4.08±2.17)%的比较，P均＜0.05，并且肺结核患者表达的IL-17、IL-22、TNF-α、IFN-γ增高。 5.将γδT细胞和PMN分成六个处理组,各组分别产生的IL-17为IL2(1.13±0.36)%、MTB-Ag(1.28±0.47)%、 HDMAPP(0.76±0.86)%、 IL2+PMN(0.98±0.58)%、MTB-Ag+PMN(0.99±0.49)%、HDMAPP+PMN(0.94±0.93)%,这六个处理组产生IL-17没有显著性差异。各组分别产生的IFN-γ为IL2(39.6±14.52)%、MTB-HAg(56.55±10.5)%、HDMAPP(49.15±14.33)%、IL2+PMN(39.11±12.78)%、MTB-HAg+PMN(41.51±9.48)%、HDMAPP+PMN(51.11±14.88)%，加入PMN对γδT细胞在MTB-HAg和MTB-HAg+PMN处理组中产生IFN-γ有影响，P＜0.05，且在MTB-HAg加入PMN后产生IFN-γ减少。 6.将PBMC分别加入IL2、MTB-HAg、HDMAPP、MTB-HAg+IL2、HDMAPP+IL2分为5组处理，NK细胞的CD69在MTB-HAg+IL2处理组中在12h达到高峰。NK细胞的CD25在MTB-HAg处理组中在48h达到高峰。结论： 1.肺结核病初治组外周血NK细胞数量明显低于健康组。 2.肺结核患者NK及CD8+T细胞中颗粒溶解素，穿孔素和颗粒酶的表达和健康人组无明显差异。 3. TB患者外周血中NK细胞分泌IL-22IL-17和TNF-α、IFN-γ的浓度均明显高于HD。 4．PMN对γδT细胞在各处理组中产生IL17没有影响。PMN对γδT细胞产生IFN-γ有影响，能使γδT细胞产生IFN-γ减少。
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【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】