抗Ⅱ型志贺毒素人鼠嵌合抗体IgG真核表达及鉴定

发布时间：2018-11-02 12:25

【摘要】：肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagie Escherichia coli, EHEC) O157:H7自1982年被确认为致病菌以来的20多年中,其引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7因其能导致人类严重消化道疾病及严重并发症如溶血性尿毒综合征(HUS)而日益受到各国卫生预防机构的重视,它产生的II型志贺毒素(Shiga toxin type Ⅱ, Stx2)现已被认为是最为重要的致病因子。然而目前临床上对EHEC0157:H7感染尚缺乏有效的防治方法,而抗生素可促使0157菌释放志贺毒素,而使患者并发HUS的危险性增加。本课题组已制备一株抗EHEC O157:H7Stx2的鼠源单抗S2C4,该单抗的重轻链同种型分别为IgGl和K,其靶标表位位于Stx2的A亚基。该单抗已被证实可中和包括Stx2和其多个变种(如Stx2c,Stx2vha等)的生物活性,具有较广的中和谱。但鼠源性单抗对人体有免疫原性,既会产生人抗鼠抗体(HAMA)诱发过敏反应,又不能有效激活人体的生物效应功能,在人体内的半衰期也较短,因此,鼠源性单抗的这些自身局限性极大地限制了其作为治疗制剂在人体内的应用。人鼠嵌合抗体虽然仍有30%左右的鼠源性成分,但90%的HAMA反应是针对抗体恒定区的,所以,嵌合抗体能有效降低人体内的HAMA反应。因此,本文拟制备人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG,对其进行免疫学活性鉴定,观察cS2C4-IgG在体内外对Stx2的中和作用,为研发有效治疗肠出血性大肠杆菌感染的抗体药物提供技术贮备。研究目的 1.对鼠源单抗S2C4进行基因工程改造,构建真核表达载体pAc-k-CH3-Vκ-VH,并利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG。 2.对cS2C4-IgG进行免疫学活性鉴定,观察cS2C4-IgG对毒素Stx2的细胞中和作用和小鼠体内保护作用。研究方法 1.从分泌抗肠出血性大肠杆菌II型志贺毒素中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因,构建人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG真核表达载体并转染Sf9昆虫细胞,收集培养上清,采用Protein A亲和层析柱纯化,获得人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG。 2.通过SDS-PAGE、Wester、免疫荧光、ELISA等方法,鉴定人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG的免疫学特性。 3.人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG的体外中和试验,检测cS2C4-IgG和鼠源单抗S2C4中和毒素Stx2对vero细胞的中和作用,24h后观察记录细胞存活情况,直至96h后结束。 4.人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG的动物保护作用,检测cS2C4-IgG和鼠源单抗S2C4中和毒素Stx2对小鼠的保护作用。每天观察小鼠存活情况,直至第12天结束,计算保护率。研究结果 1.扩增获得的鼠源单克隆抗体S2C4VH大小为354bp,Vκ大小为330bp。成功构建人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG真核表达载体；获得纯度较高的人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG。 2.Wester、免疫荧光等方法均证明cS2C4-IgG能够有效与毒素Stx2结合；Western Blot可观察到cS2C4-IgG与毒素Stx2的A亚基及其裂解片段A1结合；ELISA结果表明纯化后的cS2C4-IgG仍保持与特异性抗原毒素Stx2结合能力。 3.人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG和鼠源单抗S2C4都能中和5TCID50剂量的毒素Stx2,并且随着抗体剂量的增加,抗体对毒素感染细胞的中和作用也增强。cS2C4-IgG与S2C4的100%中和作用滴度均为1250μg/L(即62.5ng/50μL), cS2C4-IgG的50%中和作用滴度(IC50)为39μg/L(即1.9ng/50μL);S2C4的50%中和作用滴度(IC50)为58.5μg/L(即2.925ng/50μL)。 4.腹腔注射3.8～30μg只的cS2C4-IgG对小鼠的保护率可达83%～100%,1.9μg,/只以下的剂量对小鼠无保护作用；腹腔注射3.8～30μg,/只的S2C4对小鼠的保护率可达91%-100%,1.0μg／只以下的剂量对小鼠无保护作用。结论 1.本研究通过杆状病毒昆虫细胞表达系统成功获得了人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG,该抗体能够有效与毒素Stx2的A亚基结合,保留了亲本鼠单抗S2C4与特异性抗原的结合能力。 2.人鼠嵌合抗体cS2C4-IgG对纯化毒素Stx2感染的细胞具有较好的中和作用,对纯化毒素Stx2感染的小鼠具有较好的保护作用,与亲本鼠源单S2C4的作用一致。提示cS2C4-IgG具有潜在的临床应用价值,为进一步研发有效治疗肠出血性大肠杆菌感染的抗体药物提供了技术贮备。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】