乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用

发布时间：2018-11-04 15:04

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV))感染是严重危害人类健康的主要疾病之一。尽管预防性乙肝疫苗的广泛接种,极大的降低了HBV感染的发病率,但仍存在部分疫苗无/低应答人群及免疫逃逸现象,因而迫切需要研制新型有效的治疗性疫苗,打破机体的免疫耐受状态；并且由于HBV宿主范围狭窄,只感染人和少数灵长类动物,缺乏理想的小动物模型,限制了人们对HBV生物学特性、发病机制及新型疫苗与药物的研发和评价等方面的研究。基于HBV动物模型研究现状及疫苗发展的需求,本文在前期研究的基础上,将1.3拷贝的HBV基因组插入到自灭活HIV-1慢病毒载体系统转移载体骨架,构建重组的HBV转基因载体,并利用高压尾静脉注射的方法注入到小鼠体内,建立HBV成体转基因小鼠模型；同时制备含S+PreS1融合抗原的新型HBV颗粒样疫苗与重组病毒载体疫苗,优化不同佐剂组合方案或颗粒样疫苗与不同重组病毒载体疫苗联合应用,分析其在小鼠中诱导的抗原特异的免疫应答,初步优化HBV疫苗的免疫方案；进一步利用已建立的HBV成体转基因小鼠模型,基于前期优化的新型HBV疫苗的免疫方案,综合分析HBV疫苗所诱导的抗原特异性免疫应答特点,并评价疫苗免疫后在HBV感染小鼠体内的免疫保护和免疫清除作用。本研究取得的主要结果简述如下：一、乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化 1、HBV基因组转导质粒的构建与结构优化利用慢病毒载体系统的转基因质粒pCS-CG骨架,筛选出正向插入1.3拷贝HBV基因组的pCS-HBV1.3K转基因载体质粒最适宜用作后续实验研究。 2、两种HBV转基因载体质粒(pCS-HBV1.3与pAAV-HBV1.3)用于建立HBV成体转基因小鼠模型的比较分别将筛选出的pCS-HBV1.3K(以下简称pCS-HBV1.3)与前期构建的pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,比较HBV标志物的表达,发现pCS-HBV1.3注射后,小鼠体内上述HBV标志物持续时间长,抗体出现晚,且肝组织中HBV DNA水平高,因而确定转基因载体质粒pCS-HBV1.3更适合于建立HBV持续感染动物模型。 3、小鼠品系、性别、年龄及质粒注射量对建立HBV成体转基因小鼠模型的影响分别选择不同品系(C57BL/6和BALB/c)、不同剂量(5μg或10μg)、不同年龄(6周龄和18周龄)、不同性别的小鼠注射pCS-HBV1.3质粒,发现6周龄雌性C57BL/6小鼠更适合建立HBV持续感染模型。二、新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠中诱导的免疫应答特征分析 1、HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备与鉴定分别构建制备了含HBVS+PreS1、C+PreS1融合抗原的重组痘苗病毒载体疫苗,含HBV S+PreS1融合抗原的重组腺病毒载体疫苗,证实目的蛋白的表达；用电镜及免疫电镜的方法证实CHO表达的含S+PreS1融合抗原疫苗HBSS1的表达及颗粒结构。 2、含HBV S+PreS1融合抗原的新型颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价比较含HBV S+PreS1融合抗原的蛋白颗粒疫苗和重组痘苗病毒的不同联合免疫策略,发现HBV新型蛋白颗粒疫苗初免、重组痘苗病毒加强后可加速抗体阳转,产生高水平的S及PreS1的特异性抗体和细胞免疫反应,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α产生,明显优于蛋白颗粒疫苗同源免疫方案及重组痘苗病毒初免、蛋白颗粒疫苗加强的联合免疫方案。 3、HBV颗粒样疫苗结合不同佐剂初免与重组腺病毒载体疫苗联合免疫诱发的免疫应答特点分析HBV疫苗应用CpG和A1(OH)3佐剂可提高HBVS蛋白疫苗的抗体阳转率和抗体滴度,并且重组腺病毒加强以后,抗原特异性的细胞免疫亦有所增强；而对于含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗,CpG和PolyI：C联合铝佐剂可产生高水平的S及PreS1的特异性抗体以及抗原特异性的细胞免疫反应,HBSS1联合Poly I:C/Alum混合佐剂初免重组腺病毒加强后,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-y和IL-2产生；未观测到CNB佐剂及其联合Alum佐剂后对HBSS1抗体反应和细胞免疫应答的增强作用。三、HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护与免疫清除效果评价 1、HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用在前述HBV疫苗免疫方案优化的研究基础上,首先选用含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗(HBSS1)与含S蛋白HBV颗粒疫苗(HBS)结合不同佐剂、或蛋白颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗(RVJSS1),或蛋白颗粒疫苗与重组腺病毒载体疫苗(rAdSSl)联合免疫小鼠,系统比较了其抗原特异性体液与细胞免疫应答特点；末次免疫后2周采用pCS-HBV1.3质粒攻击对照小鼠与各疫苗免疫小鼠建立HBV持续感染状态。然后比较小鼠血清HBsAg、HBeAg、 HBV DNA及肝组织DNA表达水平变化。发现在上述疫苗免疫后诱导的抗S抗体均能清除血清HBsAg;而HBSS1联合RVJSS1或rAdSSl可同时清除血清HBsAg和HBV DNA,并可显著降低血清HBeAg的表达水平。进一步采用统计学方法分析疫苗诱发的免疫应答与免疫保护的相关性,发现免疫保护除与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答相关外,还与其诱发的多种抗原特异性的细胞因子密切相关。 2、HBV转基因小鼠模型在HBV新型疫苗免疫清除评价中的应用选取6周龄的C57BL/6小鼠,在免疫前5天尾静脉高压注射5μgpCS-HBV1.3,建立HBV慢性感染的小鼠模型,之后接受不同方案HBV疫苗的组合免疫,如前所述,采用多种方法系统分析不同HBV疫苗免疫方案所诱导的抗原特异性免疫应答及HBV慢性感染的小鼠血与肝组织中HBV标志物,并用统计学方法分析免疫应答与HBV清除效果的相关性。结果发现：HBSS1联合重组痘苗病毒或重组腺病毒载体疫苗,可清除血清HBsAg抗原血症,显著降低血清中HBeAg及HBV DNA水平；清除效果主要与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答和Thl型细胞免疫应答密切相关。本研究结果为新型HBV疫苗的进一步研发与应用奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62;R-332;R392

【参考文献】