新型DNA疫苗pP24-Mtb的构建及其免疫学特性的研究

发布时间：2018-11-06 14:01

【摘要】：结核炳(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的以呼吸系统感染为主的慢性传染疾病。全球约有1/3的人口感染了结核,且每年的新增病例约有900万,并约有200万的死亡病例。而在过去的三十年间,人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的感染与结核病的流行越来越息息相关。全球约有1400万人共感染了Mtb和HIV。HIV的感染是导致潜伏性结核感染发展为活动性结核病的最重要原因,使潜伏性结核20-30倍更多的可能发展为活动性结核。同时Mtb也是导致艾滋病死亡的最重要原因之一,约占艾滋死亡人数的四分之一。在同一个宿主内,这两种病原体,Mtb与HIV,相互间起着协同作用,可以互相促进彼此在体内的复制及致病性,能够加速宿主免疫功能的衰退并导致宿主死亡。另外由于两种病原体共感染的复杂性给疾病的诊断及有效治疗也提出了严峻的挑战,尤其对那些有大量共感染人群的国家如非洲及亚洲的许多国家的卫生保健系统产生了巨大压力。目前最经济有效的防控方法便是采用疫苗。然而,目前唯一批准人类使用的结核疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)并不能有效的预防成人中最常见形式的结核病——肺结核,并且也不能阻止Mtb的传播。同样地,尽管已经有一些HIV候选疫苗正在进行临床试验的评估,但到目前为止仍然没有批准有效的预防性HIV疫苗。因此,研制一个有效的疫苗使其能在抗结核的同时还具有抗HIV的免疫原性是十分必要的。机体在抗结核的过程中主要是通过T细胞免疫应答。因此选用能够诱导T细胞应答的T细胞表位是一种理想的疫苗设计方式。选择性将多个强免疫原性T细胞表位应用于一个疫苗中不仅能够诱导更广泛更强烈的T细胞应答,还能避免由抗原中其他不利成分引起的不良反应或逃逸作用。然而表位作为短肽单独使用时免疫原性低,需要连接于载体蛋白。传统的方式是将表位直接进行串联连接于载体蛋白,但这种方式被证明不能全面诱导每个表位的特异性应答。本研究通过将表位构铸到载体蛋白的不同区域中以期保持各表位的强免疫原性。以往的研究证明天然结构蛋白是理想的载体蛋白。p24蛋白是HIV-1的一个免疫优势抗原,能够诱导强烈的体液及细胞免疫应答。有效的抗HIV-1免疫应答主要就是通过体液及细胞免疫应答两者的相辅相成作用。因此本研究通过将p24蛋白作为插入结核表位的载体蛋白,构建得到一个同时抗Mtb/HIV-1的疫苗pP24-Mtb。通过将pP24-Mtb质粒免疫小鼠,检测诱导的特异性免疫应答及免疫保护力,获得了以下结果：一、新型DNA疫苗pP24-Mtb的分子设计及构建表达根据网络数据库及相关文献报道,我们选择从MPT64、Ag85A、Ag85B及TB10.4四个结核优势抗原中选择T细胞表位,再通过表位预测软件确定MPT6476-84、Ag85A242-250、Ag85B184-192、TB10.474-82四条功能性T细胞表位作为疫苗所要插入的结核表位。另外根据相关文献确定以HIV-1p24优势抗原作为插入结核表位的载体蛋白。根据蛋白空间结构预测软件得到p24蛋白的二级和三级结构,并结合文献分析确定最终的插入位置,即：在p24N端laa之前插入MPT6476-84表位；在91aa之后插入Ag85A242-250表位；在101aa之后插入Ag85B]84-192表位；在147aa之后插入TB10.474-82表位。根据以上设计方案,构建疫苗pcDNA3.1-P24-Mtb及各对照质粒。首先以pET11a-P24为模板,经PCR扩增出p24基因片段,经酶切定向插入到真核表达载体pcDNA3.1中,构建得到重组表达质粒pcDNA3.1-P24。为了构建pcDNA3.1-P24-Mtb质粒,我们设计了包含有4条结核分枝杆菌T细胞表位并且相互间有重叠互补序列的各条p24特异性引物,以pcDNA3.1-P24质粒为模板,通过基因重叠延伸拼接PCR技术得到最终的p24-Mtb基因片段。经过同样的酶切步骤定向连接于pcDNA3.1中,得到pP24-Mtb DNA疫苗。通过PCR、特异性双酶切及测序鉴定所构建质粒正确。为分析质粒的体外表达情况,将p24及p24-Mtb基因片段经双酶切后克隆至pET32a质粒中,经IPTG体外诱导表达并经亲和层析纯化柱得到纯度超过80%的蛋白。纯化蛋白经Western Blot鉴定,均能和小鼠抗p24抗体结合,证明了质粒的正确表达也说明了其空间结构的完整性。二、 pP24-Mtb疫苗中结核表位的免疫反应性研究以往的研究发现疫苗中将表位直接串联的方式并不能使每个表位都发挥作用,为了对比串联表位方式与pP24-Mtb构铸表位方式的优越性,我们构建了表位串联对照质粒pP24pep,即将四个结核表位串联后连接于p24蛋白的C末端。同样以pP24质粒为模板,通过基因重叠延伸拼接PCR技术得到p24pep基因片段,经酶切连接入pcDNA3.1中。将pP24-Mtb、pP24pep及pcDNA3.1(vector)三种质粒分别肌肉免疫BALB/c小鼠,隔周免疫,共4次。于末次免疫后2周取脾脏淋巴细胞从特异性增殖反应、IFN-y生成细胞、CTL应答及细胞因子的分泌水平等方面分析了各组中表位的反应差异性。 1)首先我们检测了淋巴细胞针对四个混合结核表位肽产生的特异性细胞免疫应答,发现与vector空质粒组相比,pP24-Mtb与pP24pep免疫后均可以产生较高水平的混合表位肽特异性的增殖反应、产生大量的IFN-γ分泌细胞、诱导较强的CTL杀伤应答并分泌大量的Thl型细胞因子(IFN-γ、TNF-α),然而pP24-Mtb组与pP24pep组间并无显著差异,提示pP24-Mtb、pP24pep免疫均可以促进针对混合表位肽特异性的细胞免疫应答。 2)为了进一步探讨两质粒对各表位免疫原性展现的差异性,我们在体外用每一个单表位肽进行刺激,结果发现：pP24-Mtb免疫组对四个表位肽均可以产生特异性增殖反应,而与之相比,pP24pep免疫组仅可以产生Ag85A242-250和Ag85B184-192表位特异性增殖反应,而对MPT6476-84和TB10.474-82表位则没有。另外pP24-Mtb组还可以产生每个表位特异性的IFN-γ分泌细胞,而pP24pep组仅能产生针对Ag85A242-250和Ag85B184-192表位的IFN-γ分泌细胞,而对MPT6476-84和TB10.474-82表位的应答则远弱于pP24-Mtb组。同样,pP24-Mtb组可以诱导较强的四个单表位特异性CTL杀伤率及Thl型细胞因子,而pP24pep组则仅对两个表位产生较强的应答。因此提示pP24-Mtb质粒可以保持每个表位的强免疫原性,使每个表位都能产生相应的特异性免疫应答,而pP24pep质粒仅能保持其中两个表位发挥作用。 3)在此基础上,为了进一步模拟天然感染状态时两种质粒中表位的反应差异性,我们采用热灭活的BCG (HK BCG)体外刺激脾细胞,结果发现pP24-Mtb免疫组可以产生显著高于pP24pep免疫组的增殖反应。另外,pP24-Mtb组经HKBCG刺激后能够产生大量的IFN-γ分泌细胞,显著高于pP24pep组。同样pP24-Mtb免疫组还可以诱导高水平的HK BCG特异性CTL杀伤率及Thl型细胞因子,远高于pP24pep免疫组。因此通过上述研究我们发现,将表位构铸到载体蛋白不同区域中的疫苗构建方式相比传统的将表位串联的构建方式更能维持每个表位的强免疫原性,从而诱生每个表位特异的免疫应答,避免出现表位功能丧失的现象而使应答不全面。另外表位构铸的方式使表位更接近于其在天然抗原中的存在形式,从而在灭活菌刺激下诱导更为强烈的免疫应答,且这种应答更接近于机体天然感染状态时产生的应答,因此可能介导更为有效的保护作用。在接下来的研究工作中,我们将探讨该疫苗诱导的特异性免疫应答及免疫保护作用。三、 pP24-Mtb疫苗诱导的特异性免疫应答及免疫保护作用研究分别以pP24-Mtb, pP24, pcDNA3.1(vector)肌肉免疫小鼠,隔周免疫,共4次。BCG经皮下免疫5×105CFU,仅一次。隔周收集小鼠血清。从诱导的Mtb及HIV-1特异性体液及细胞免疫应答的各个方面进行了检测分析,结果发现： 1)在体液免疫应答方面,因为选择的是结核T细胞表位,因此疫苗并不能产生结核特异性抗体,我们重点关注了HIV-1特异性抗体的产生。pP24-Mtb可以显著提高血清p24特异性IgG抗体的滴度,第10周达到高峰,滴度达到1：4000,显著高于同期pP24疫苗组(1：2250)。更有意义的是,pP24-Mtb免疫促进了抗体亲合力成熟,诱生了高亲合力抗体的产生。高水平高质量的抗体对于有效预防HIV-1感染和清除病毒极为重要。 2)在细胞免疫应答方面,我们首先检测了疫苗诱导的结核及HIV-1特异性淋巴细胞增殖反应,发现pP24-Mtb免疫后可以产生高水平的结核特异性增殖反应,并且与BCG免疫组的应答无显著差异。同时,pP24-Mtb疫苗还可以产生强烈的p24特异性增殖反应,增殖指数达到3.7。提示pP24-Mtb疫苗不仅能够产生结核特异性的细胞增殖反应,还可以促进HIV-1特异性的淋巴细胞增殖功能。 3)特异性IFN-γ分泌细胞检测发现：pP24-Mtb免疫组可以产生大量的结核特异性IFN-γ分泌细胞,并与BCG的IFN-γ分泌细胞频率相似。另外,与pP24组相比,pP24-Mtb免疫小鼠能够产生更多的p24特异性的IFN-γ生成细胞。提示pP24-Mtb疫苗能够促进产生结核及HIV-1特异性的IFN-γ分泌细胞。我们进一步检测了分泌IFN-γ的淋巴细胞亚群比例,pP24-Mtb免疫后CD4+IFN-γ+T细胞与CD8+IFN-γ+T细胞比例都显著高于vector空质粒组,与BCG免疫组相似。另外,pP24-Mtb组同时还能促进p24特异性CD4+/CD8+IFN-γ+T淋巴细胞的产生。结果说明pP24-Mtb疫苗能够促进机体产生结核及HIV-1特异性的Th1型应答并提示能够产生CD8+CTL应答。 4)特异性CTL活性检测发现：pP24-Mtb免疫小鼠的淋巴细胞有更高水平的结核特异性CTL杀伤率,与BCG组相似,达到50%。与此同时,pP24-Mtb还能产生强烈的p24特异性CTL杀伤率,并显著高于pP24组。进一步证明了pP24-Mtb免疫能够同时增强结核及HIV-1特异性CTL应答。 5)特异性细胞因子的检测发现：pP24-Mtb疫苗能够诱导大量结核特异性的Thl型细胞因子的表达(IFN-γ、TNF-α),而Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的表达水平非常低。此外,pP24-Mtb免疫组与pP24免疫组相比,可以诱生更高水平的p24特异性Thl型细胞因子,而Th2型细胞因子的水平也非常低。进一步证明pP24-Mtb免疫后能够同时促进结核及HIV-1特异性细胞免疫应答向Th1型偏移。 pP24-Mtb疫苗成功诱导了强烈的抗结核T细胞免疫应答,并且其应答强度与BCG无显著差异,提示其诱导的特异性免疫应答可以介导有效的保护作用。我们通过建立小鼠结核感染模型评价了该疫苗的抗结核保护效果,结果显示： 1)与vector对照组相比,pP24-Mtb可以显著减少小鼠肺脏及脾脏中的结核菌落数,并且与BCG免疫组减少菌落数的水平相当,没有显著差异。提示pP24-Mtb疫苗能够有效抑制感染的结核菌在局部及系统性组织中的复制,并且达到与BCG疫苗相似的水平。 2)在观察感染部位肺脏中结核所致的病理损伤情况时发现,在pP24和vector对照小鼠肺组织中有明显的炎性细胞浸润以及类肉芽肿样病变,正常的肺泡结构被破坏,炎症范围分别达到60%和75%。而在pP24-Mtb和BCG免疫组,仅见少量炎性细胞浸润,且肺泡结构无明显异常,与正常对照组接近。进一步证明pP24-Mtb疫苗能够产生有效的抗结核保护效果,抵抗结核感染,并且其保护效果与BCG疫苗相似。本研究通过将强免疫原性的结核T细胞表位构铸到HIV-1p24蛋白的不同区域中构建得到新型DNA疫苗pP24-Mtb。观察了其与传统表位构建方式相比的构建合理性与优越性,其能使每个表位都诱导更接近于天然感染状态时产生的特异性免疫应答。在分析诱导的结核及HIV-1特异性免疫应答时确定了pP24-Mtb疫苗能够同时诱生全面有效的抗结核及抗HIV-1免疫应答。并且证明了该疫苗在结核感染后展现了有效的保护作用。本研究为抗共感染疫苗的分子设计提供了新的思路和技术平台。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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