接头蛋白TAB1和GNB2L1调节p38α的结构基础

发布时间：2018-11-07 15:28

【摘要】：p38亚家族蛋白激酶与ERK(extracellular signal-regulated kinase)和JNK(c-Jun NH2-terminal protein kinase),同属MAPK(mitogen-activated protein kinase)超家族成员。p38的经典活化模式为MAPK家族成员所共有,即MAP3K(MAPK kinase kinase)磷酸化MAP2K(MAPK kinase),MAP2K磷酸化MAPK的级联酶促反应。p38依靠活化环中Thr-Gly-Tyr模序上180位的苏氨酸(Thr180)和182位酪氨酸(Tyr182)发生磷酸化而活化。MKK3和MKK6是p38经典活化通路中两个主要的上游MAP2K,UV等物理性刺激或者TNF-α等炎性因子刺激可以通过它们活化p38。除了经典活化之外,p38还存在替代活化模式,通过不依赖上游激酶的分子内自我磷酸化作用,使Thr180和Tyr182位点磷酸化而活化。 p38一直被认为是介导炎症反应的中心分子。然而,大量的证据包括我们最近的研究表明,p38在细胞生与死的精确调控中也扮演重要角色。p38的两种不同活化模式:级联磷酸化或者自我磷酸化,都参与细胞死亡调控。近几年我们小组的几项研究揭示,通过经典模式活化的p38能够促进核因子-κB (NF-κB)获得充分的转录活性,从而在普通成纤维细胞或者成纤维瘤L929细胞中拮抗TNF-α诱导的死亡。而其他的一些研究表明,p38的一种替代活化方式,即与接头蛋白TAB1[transforming growth factor-β(TGF-β)-activated protein kinase 1 (TAK1)-binding protein 1]相互作用后引起的自我磷酸化,介导缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。尽管p38在细胞生死调节机制中的重要性已经被证实,然而,其中p38活化的详细分子机制仍不清楚。接头分子TAB1只能与p38家族的p38α发生相互作用,而不与p38的其它亚型作用,这种相互作用的特异性使之成为防治心肌缺血再灌注损伤的潜在靶位,所以,精确了解TAB1/p38α相互作用复合物的3-D结构成为必须。另外,接头蛋白早已被证实是ERK和JNK经典模式活化所必不可少的,然而参与p38经典模式活化的接头蛋白还鲜有报道。我们小组前期工作证实GNB2L1,一个以Trp-Asp(WD)重复序列为特征并广泛参与多条通路调节的的接头蛋白,可直接结合MKK7,从而促进TNF-α诱导的JNK活化。GNB2L1能否调节TNF-α诱导的p38活化并由此来调节细胞死亡就成为我们很关心的问题。 在本次研究中,借助同源模建、从头搭建和分子对接等计算机分子设计技术,与传统分子生物学手段一起,我们找到了TAB1与p38α相互作用的关键氨基酸。在p38α中,Asp230和Tyr258是我们新发现的两个p38α与TAB1结合的关键氨基酸;先前报道过的Thr218也在模建预测的关键氨基酸中。相应的,TAB1中的相对应的关键氨基酸为Ser399、Ser401、Asn436和Thr440,均为首次报道。关键氨基酸点突变后能够减弱或者增强TAB1/p38α相互作用,均与分子模建预测相符;但有趣的是,突变后无论结合能力变强或是变弱,TAB1介导的p38α的自我磷酸化都明显降低;这提示p38α实现自我磷酸化对结构具有高度依赖性,只有最适度的相互作用才能实现最佳的自我磷酸化。基于上述发现,我们设计了能够阻断TAB1/p38α相互作用的拮抗肽PT1-PT6,并在细胞水平进行体内、体外实验对拮抗肽的活性进行评价。最终,我们选择了效果最好的PT5,并合成带有穿膜肽的D构象PT5(防止体内降解)来进行动物实验。多肽合成时,HIV的TAT穿膜序列通过两个D型脯氨酸(D-Pro)连接在D型PT5的羧基端。细胞内,D-PT5能够阻断TAB1/p38α相互作用并抑制TAB1介导的p38α自我磷酸化发生。进一步,D-PT5在大鼠实验中,显著降低了缺血再灌注后的心肌损伤。我们的工作为设计一个通过特异阻断TAB1/p38α相互作用来治疗心肌缺血再灌注损伤的药物提供了理想的先导结构。 在本文另一部分研究中,我们发现GNB2L1与MKK6在体内和体外均能发生相互作用,发生结合的关键区域在GNB2L1的WD1结构域。GNB2L1过表达能够增强p38的磷酸化并促使L929细胞拮抗TNF-α诱导的死亡;而WD1结构与缺失的GNB2L1则不能显示出这种效应。GNB敲低后,则显示出与过表达相反的效应。我们的工作发现了一个新的调节p38经典模式活化的接头蛋白。
[Abstract]:p38浜氬�舵棌铔嬬櫧婵�閰朵笌ERK(extracellular signal-regulated kinase)鍜孞NK(c-Jun NH2-terminal protein kinase),鍚屽睘MAPK(mitogen-activated protein kinase)瓒呭�舵棌鎴愬懀�

本文编号：2316782