湖北钉螺慢性感染阶段免疫防御相关基因的筛选和鉴定

发布时间：2018-11-18 12:20

【摘要】：钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主。血吸虫幼虫在螺体内的发育过程,即从尾蚴侵入螺体,经母胞蚴、子胞蚴等无性繁殖,形成尾蚴,直至逸出螺体,是血吸虫完成完整的生活史和导致疾病传播的必需阶段。螺类能否被成功感染和寄生,是血吸虫的感染能力和螺宿主的防御能力共同作用的结果。因此,对于血吸虫—螺宿主之间相互关系的研究对于最终控制血吸虫病的传播具有重要的生物学和医学意义。本研究以自然感染血吸虫的湖北钉螺为研究对象,首先利用抑制差减杂交技术,建立了湖北钉螺头足部(富含淋巴细胞和淋巴液,被认为是螺体天然防御系统的重要部位)在慢性感染阶段的正向(阳性钉螺中高表达的转录子)和反向(阴性钉螺中高表达的转录子)cDNA文库。共获得884个克隆,其中正向文库648个,反向文库236个。经PCR鉴定,695个克隆的PCR产物为大于100bp的单一有效条带,其中正向文库511个,反向文库184个。经进一步测序,排除无效序列,并通过ClustalX分析,获得102条独立序列,其中正向文库转录子60个,反向文库转录子42个。在此基础上,通过斑点杂交进一步筛选,获得在慢性感染阶段有显著表达差异的转录子39个,其中正向文库9个,反向文库30个。经BLAST分析,从已有的数据库中检索出与转座酶,小窝蛋白样蛋白,胰蛋白酶抑制剂样蛋白,鞘脂激活蛋白原,谷胱甘肽转移酶和某些假定蛋白等具有同源性的基因,但大部分转录子无法从现有的数据库中获得有效信息。经GO分析,这些被鉴定的基因功能主要与细胞生长、代谢、信号传导及免疫反应有关。在对39个转录子进行半定量PCR的基础上,选择了其中的13个转录子(2个正向文库转录子,11个反向文库转录子)进行了荧光定量PCR,其中10个转录子表现出与抑制差减杂交结果一致的上调或下调表达水平。在此基础上,选择了7个转录子进行了cDNA全长的扩增和克隆,包含正向文库的HS576353和HS576355,反向文库的HS576359,HS576367,HS576368,HS576380和HS576382。cDNA全长序列表明HS576353和HS576355来源于同个基因的不同区域,但经BLAST分析,未能在现有数据库中找到同源性基因。HS576359的cDNA全长与HS576353(HS576353)的cDNA全长序列有部分同源,可能为具有不同功能的同一类基因。胶原蛋白,谷胱甘肽转移酶和胰蛋白酶抑制剂素等分别被克隆和鉴定。以胰蛋白酶抑制剂为代表,检测了其在钉螺人工感染后3h至64d,表达水平的变化。其表达水平从感染早期的上调水平逐渐降至感染后期和慢性期的下调,提示胰蛋白酶抑制剂在钉螺的免疫防御反应中发挥了重要作用,在感染早期参与寄生虫的清除和灭活过程,而在后期至慢性阶段协助钉螺免疫防御系统处于抑制状态,有助于寄生虫与钉螺之间的平衡和共存。根据基因的表达水平差异和功能分析预测,有必要进一步对谷胱甘肽转移酶,胰蛋白酶抑制剂样蛋白,钙联蛋白相关基因(HS576367)口某些未知基因HS576353、HS576359等进行功能研究。这些已鉴定的具有显著表达差异的基因可能在血吸虫—螺类的相互关系中发挥重要作用,有助于深入认识钉螺的天然防御系统,特别是在共存适应阶段的分子机制。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R383.2

【参考文献】