5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌细胞分化及相关信号通路研究

发布时间：2018-11-20 08:23

【摘要】：第一部分体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立 目的探讨并建立体外培养并应用5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导人脐带源间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分化为心肌细胞的实验方法，同时探索诱导分化的合适5-aza浓度，为基础和临床hUCMSCs移植修复损伤心肌提供实验依据。 方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUCMSCs,采用终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L及40μmol/L的5-aza对P3代hUCMSCs进行诱导24h后去除5-aza继续培养4周,采用倒置显微镜观察细胞生长情况和形态学的变化,流式细胞仪测定hUCMSCs表面免疫标记。同时免疫组织化学方法测定各组心肌细胞特异蛋白肌钙蛋白(cTnI)的表达，不同浓度组分别随机选取5个高倍视野进行细胞计数，统计cTn I阳性细胞的百分率(%)即诱导分化率。 结果采用贴壁培养法可从脐带组织获得大量hUCMSCs，诱导前呈典型的梭形；诱导后1~2周细胞体积变大,纺锤形细胞比例下降,多数细胞呈杆状,少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞核质比例明显降低,胞质内有细小的颗粒样结构,且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，细胞胞质内可见细丝样结构。流式细胞仪鉴定结果表明，hUC MSCs表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105，不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR，且经反复多次传代后，，抗原表达无明显改变。在加入5-aza后24h，在不同浓度的实验组中均有不同程度的hUC MSCs死亡现象，其中5μmol/L和10μmol/L的5-aza组仅有少量细胞(5%左右)死亡，而20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L浓度的5-aza组约35%的细胞死亡。随着培养时间的增加,高浓度组(10μmol/L组)细胞死亡的数量也随之增加，至第4周，20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L浓度的5-aza组死亡细胞数已增加到60%以上,而5μmol/L和10μmol/L的5-aza组死亡细胞数在10%左右。5-aza诱导4周后免疫组织化学鉴定cTnI表达阳性，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L及40μmol/L的5-aza诱导组cTnI阳性细胞的比率分别为(13.20±3.03)%、(32.20±3.35)%、(25.60±2.30)%、(24.40±3.51)%及(22.60±2.41)%；对照组未见肌管状细胞出现，免疫组织化学鉴定cTnI表达阴性，cTnI阳性细胞的百分率(%)为0，经方差分析结果得出各组之间有统计学差异(P 0.05)。比较两组之间的差异,采用Student-Newman-Keuls检验,结果示5μmol/L和10μmol/L5-aza诱导组之间及与其他组之间都有差异(P 0.05),20μmol/L、30μmol/L和40μmol/L5-aza诱导组之间没有差异，其中分化率最高的为10μmol/L5-aza诱导组。 结论人脐带贴壁培养可获得大量的hUC MSCs，hUCMSCs体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞，10μmol/L的5-aza是诱导hUCMSCs向心肌细胞分化的最佳浓度。 第二部分5-氮杂胞苷诱导人脐带源间充质干细胞分化为心肌细胞的分子机制探讨 目的：研究GATA4、Nkx2.5基因在5-aza诱导hUCMSCs分化为心肌细胞过程中的表达水平，探讨5-aza诱导hUCMSCs分化为心肌细胞的相关分子机制。 方法：足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUCMSCs,10μmol/L5-aza对P3代hUCMSCs诱导24h后继续培养4w，实时荧光定量检测诱导前后GATA4、Nkx2.5基因表达。 结果：1、4w后诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平明显上调，分别较诱导前（对照组）增加了（4.72±0.58）、（3.76±0.06）倍。2、Nkx2.5Ct值：诱导前（对照组）为12.91±0.39，诱导后（诱导组）为8.19±0.95（t=2.80，P0.05）。3、GATA4Ct值：诱导前（对照组）为15.87±1.06，诱导后（诱导组）为12.10±1.01（t=3.19，P0.05）。所有测定的Ct值均经GAPDH校正。 结论：5-aza诱导后hUCMSCs的GATA4、Nkx2.5表达上调，可能通过对GATA4、Nkx2.5基因表达的调控而促进hUCMSCs分化为心肌样细胞及促进其成熟。 第三部分DLL4-Notch信号转导通路在5-氮杂胞苷诱导人脐带源间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的表达变化 目的研究Dll4-Notch信号转导通路在5-aza诱导hUCMSCs分化为心肌细胞过程中的表达水平，探讨其是否参与hUCMSCs分化为心肌细胞过程。 方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUCMSCs,5-aza对P3代hUCMSCs诱导分化。分别在诱导后1、3、5、7d收集细胞,提取总RNA,以GAPDH为内参照,利用RT-PCR检测hUCMSCs诱导后诱导组和对照组不同时间Notch1、Dll-4基因表达水平。 结果诱导组和对照组培养第1、3、5、7天hUCMSCs的Notch1基因表达比较，诱导组Notch1基因表达量明显升高，且表达稳定，未随着时间延长而表达减弱，而对照组Notch1表达较弱，随着时间延长，表达量有减少倾向。相对于对照组，诱导组第1、3、5、7天Notch1基因表达分别增加6.60、7.36、7.595、7.805倍。诱导组4天Notch1基因表达平均Ct值0.51±0.21，对照组4天Notch1基因表达平均Ct值7.85±0.35（t=35.98, P0.01）。诱导组Dll4基因表达量明显升高，且表达稳定，未随着时间延长而表达减弱，而对照组Dll4表达较弱。与对照组相比，诱导组第1、3、5、7天Dll4基因表达分别增加11.53、10.1、10.17、11.46倍。诱导组4天Dll4基因表达平均Ct值1.60±0.49，对照组4天Dll4基因表达平均Ct值12.42±0.73（t=11.71,P0.01）。 结论利用5-aza诱导hUCMSCs向心肌细胞分化过程中,Notch信号转导通路中Notch1、Dll4分子的表达明显增高,提示Dll4-Notch信号转导通路可能参与了5-氮杂胞苷诱导hUCMSCs向心肌细胞的分化过程。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 张勇,蔡振杰,陈如坤;小鼠骨髓基质干细胞体外分化为前体心肌细胞的初步实验[J];第一军医大学学报;2005年02期

2 法宪恩;王利霞;侯剑峰;张瑞成;王海永;;5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察[J];郑州大学学报(医学版);2005年06期

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本文编号：2344384