IL-27促进树突状细胞分化成熟及其作用机制的实验研究

发布时间：2018-11-20 07:40

【摘要】：目的：观察在白介素-27（Interleukin-27, IL-27）单独作用或与TNF-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）的联合作用的情况下，对健康成年人外周血单个核细胞（Peripheral blood monocyte, PBMC）来源的树突状细胞（Dendritic cell, DC）分化、成熟和生物学功能的影响，并探讨其作用机制。方法： 1.采集正常健康人外周血15~20ml，用Ficoll-hypaque（葡聚糖-泛影葡胺）密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，加入基础细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor, GM-CSF）和IL-4体外培养5d，得到未成熟的DC。在第5d时加入刺激因子，并根据加入刺激因子的不同分为四个实验组，分别为：阴性对照组（Negative：不加入任何刺激因子）、阳性对照组（TNF-α：20ng/ml）、IL-27组（IL-27：20ng/ml）、TNF-α+IL-27组（即双细胞因子组，TNF-α：10ng/ml+IL-27：10ng/ml）。 2.利用倒置显微镜，分别观察培养至第1d、3d、5d和7d各组未成熟及成熟DC的形态。 3.通过磁珠分选的方法分离各组DC。 4.通过流式细胞术检测各组DC表面共刺激分子CD1a、CD83和CD80、CD86以及细胞表面粘附分子ICAM-1的表达水平。 5.通过RT-PCR的方法检测各组DC表面趋化因子受体CCR5、CCR7mRNA的表达情况。 6.用MTS的方法检测各组DC经丝裂霉素C处理后，刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 7.用ELISA的方法检测各组DC培养上清中细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌水平。 8.用Western-blot的方法检测各组DC信号通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3的含量。结果： 1.光镜下，在培养至第5天时，各组细胞形态均一，呈集落状生长，体积较小且胞体较圆。培养至第7天时，IL-27组和TNF-α+IL-27组DC呈现典型的成熟形态学特征，胞体较大，细胞伸出伪足，表现出明显的毛刺样结构，与阳性对照TNF-α组相比无明显差别；而Negative组细胞胞体较小，表面毛刺状突起较少，无典型DC形态。 2.流式细胞结果显示，外周血单个核细胞于体外诱导培养第7d时,Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC表面共刺激分子CD1a和CD83双阳性率分别为23.29±4.49%、42.76±3.50%、35.75±4.10%和52.49±2.65%，CD80和CD86双阳性率分别为22.66±3.20%、45.56±2.47%、39.06±1.61%和54.10±0.46%。其中IL-27组与TNF-α组相比CD1a和CD83、CD80和CD86的双阳性率均没有统计学意义（P＞0.05），而TNF-α+IL-27组的双阳性率显著高于TNF-α组和IL-27组，结果具有统计学意义（P0.05）。Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC表面粘附分子ICAM-1的阳性率分别为为21.84±0.64%、27.66±1.03%、28.47±0.94%、35.11±1.32%，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组的阳性率均高于Negative组，结果具有统计学意义（P0.05），而这三组之间ICAM-1的阳性率相比则无统计学意义（P＞0.05）。 3. RT-PCR结果显示，Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC表面趋化因子受体CCR7mRNA的表达水平分别为3.09±0.18、4.14±0.08、3.98±0.09、4.75±0.11，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组CCR7mRNA的表达水平显著高于Negative组，统计学分析发现各组之间的比较均具有统计学意义（P0.05）。四组DC表面CCR5mRNA的表达水平分别为1.23±0.03、0.86±0.02、0.99±0.03、0.61±0.02，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组CCR5mRNA的水平低于Negative组，结果具有统计学意义（P0.05），且TNF-α+IL-27组CCR5mRNA的表达水平与TNF-α组和IL-27组相比具有统计学意义（P0.05），而IL-27组与TNF-α组的表达水平无差异（P＞0.05）。 4. MTS结果显示，TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC经丝裂霉素C处理后，可明显刺激T细胞增殖。随DC与T细胞比例增加（1:100、1:50及1:10），刺激T细胞的能力增强。在DC与T细胞的不同比例下，TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组的刺激作用显著高于Negative组，，结果具有统计学意义(P＜0.05)。其中，DC与T淋巴细胞的比例在1：100和1:50时，TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组的吸光度值无统计学意义（P＞0.05），当DC与T细胞比例在1:10时，TNF-α+IL-27组吸光度值显著高于TNF-α组和IL-27组，结果具有统计学意义(P＜0.05)，而IL-27组与TNF-α组吸光度值相比无统计学意义（P＞0.05）。 5. ELISA结果显示，Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC培养上清中细胞因子IL-12的分泌水平分别为37.24±2.34pg/ml、45.83±1.09pg/ml、44.78±0.78pg/ml、49.82±0.76pg/ml，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC培养上清中IL-12的分泌水平显著高于Negative组，结果具有统计学意义(P＜0.05)，IL-27组与TNF-α组、TNF-α+IL-27组的分泌水平相比没有统计学意义（P＞0.05），而TNF-α+IL-27组与TNF-α组之间比较具有统计学意义(P＜0.05)。IFN-γ在各组的分泌水平分别为666.67±42.28pg/ml、831.90±69.88pg/ml、863.96±37.99pg/ml、1009.09±13.90pg/ml，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC培养上清中IFN-γ的分泌水平显著高于Negative组，结果具有统计学意义(P＜0.05)，IL-27组与TNF-α组比较分泌水平没有统计学意义（P＞0.05），但TNF-α+IL-27组DC IFN-γ的分泌水平较TNF-α组和IL-27组相比则显著升高，具有统计学意义(P＜0.05)。 6. Western-blot结果显示，TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组信号通路蛋白MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3水平均有不同程度升高，升高趋势以TNF-α+IL-27组更为明显。结论： 1.单独使用IL-27或与TNF-α协同作用，可诱导外周血单个核细胞来源的DC成熟。 2.经过IL-27诱导分化的DC，刺激T淋巴细胞增殖的能力增强，而且在培养上清中，分泌大量的IL-12和IFN-γ，这说明IL-27可以增强DC的生物学功能。 3.细胞因子IL-27可以直接或者协同TNF-α诱导DC成熟，其机制可能通过活化MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3等信号通路。 4.两种细胞因子联合应用，减少细胞毒性，增强细胞功能，具有更好的抗肿瘤作用，而且符合临床用药的配伍原则，具有潜在的临床应用价值。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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