HDAC1特异性抑制Runx2介导的OPN的转录活性

发布时间：2018-12-05 21:41

【摘要】：Runx2是成骨细胞分化过程中的关键转录因子之一。Runx2在诱导干细胞向成骨细胞分化过程中需要依赖染色质结构的变化和辅助因子的参与来调控Runx2与DNA的结合和Runx2的转录活性的改变。例如,抑制一种组蛋白去乙酰化酶HDAC3的活性可以显著增强骨钙蛋白基因表达、加速矿化。 我们在前人关于HDACs与Runx2的相互作用的研究成果的基础上,进一步研究了HDAC1对Runx2介导的OPN的基因表达调控的影响。首先,通过荧光双报告检测实验检测了HDAC家族成员HDAC1,3,4,5,6,7,8,10,Sirt2以及HAT家族成员P300,GCN5,CBP对Runx2介导的OPN启动子活性的影响。结果发现,只有HDAC1和HDAC3对Runx2介导的OPN启动子活性有明显抑制作用;加入HDAC抑制剂TSA后,不仅这种抑制作用消失,反而加强了Runx2介导的OPN启动子活性,而且显著地抑制了HDAC1对Runx2介导的OPN启动子活性的抑制作用。为了分辨核小体结构是否参与HDAC1的这种抑制作用,我们把OPN启动子连在能产生核小体结构的质粒载体上,并同HDAC1、Runx2转入细胞中。结果表明产生核小体的载体与不产生核小体的载体相比,HDAC1抑制Runx2介导的OPN启动子活性的作用趋势是基本相同的,而且TSA的作用效果也是基本相同的。这说明HDAC1对Runx2介导的OPN启动子活性的影响与染色质结构没有关系。 接下来,我们用免疫荧光(IF)和免疫共沉淀(Co-IP)实验,验证了HDAC1与Runx2共定位于细胞核中,猜测二者可能在同一复合物中。我们进一步用CHIP实验证实,HDAC1和Runx2都能结合到OPN的启动子上。我们通过将HDAC1瞬时转染到过表达Runx2的细胞株中发现,HDAC1显著抑制了Runx2诱导的OPN mRNA水平,但有趣的是,HDAC1对ALP mRNA水平没有影响。在HDAC1的酶活性被TSA抑制后,Runx2诱导的OPN mRNA水平明显上升,但同时Runx2诱导的ALP mRNA水平不变。这些结果说明HDAC1抑制Runx2诱导的OPN mRNA水平的作用和HDAC1抑制Runx2激活OPN启动子活性的作用是一致的,并且这种作用具有一定的特异性。 我们的免疫印迹结果显示,在诱导成骨细胞分化的第6天后,细胞中OPN的mRNA水平明显提高,与此同时HDAC1蛋白水平减弱。不仅如此,我们还同时分析了多种不同细胞系的HDAC1蛋白水平,发现随着分化程度的不断深入,其HDAC1蛋白水平也呈逐步减弱的趋势。以上结果表明,在Runx2上调OPN mRNA的水平甚至在Runx2诱导成骨细胞分化的过程中,HDAC1可能起到一种抑制性的屏障作用,当Runx2通过了这个屏障后,HDAC1就不会再对OPN的表达起到明显抑制作用,从而促进Runx2的调控作用。另外,我们还发现HDAC1对Runx2的蛋白水平没有影响,而Runx2的蛋白水平却随着分化而明显增加,因此我们猜测在成骨细胞分化过程中,可能存在HDAC1以外的某种表观遗传调控机制调控Runx2的蛋白质水平,从而影响成骨细胞分化。我们的研究初步地揭示了HDAC1抑制Runx2诱导的OPN mRNA水平的分子机制,为人们利用HDACs来治疗骨骼疾病提供了一定的理论基础。
[Abstract]:Runx2 is one of the key transcription factors in the process of osteoblast differentiation. In the process of inducing stem cells to osteoblast differentiation, Runx2 depends on the changes of chromatin structure and the participation of auxiliary factors to regulate the binding of Runx2 to DNA and Runx2. Changes in transcriptional activity. For example, inhibiting the activity of a histone deacetylase HDAC3 can significantly enhance osteocalcin gene expression and accelerate mineralization. On the basis of previous studies on the interaction between HDACs and Runx2, we further studied the effect of HDAC1 on the regulation of OPN gene expression mediated by Runx2. Firstly, the effects of HDAC family member HDAC1,3,4,5,6,7,8,10,Sirt2 and HAT family member P300GCN5CBP on OPN promoter activity mediated by Runx2 were detected by fluorescence double report assay. The results showed that only HDAC1 and HDAC3 could inhibit the activity of OPN promoter mediated by Runx2. The addition of HDAC inhibitor TSA not only decreased the inhibitory effect, but also enhanced the OPN promoter activity mediated by Runx2, and significantly inhibited the inhibition of HDAC1 on Runx2 mediated OPN promoter activity. To determine whether the nucleosome structure is involved in the inhibition of HDAC1, we attach the OPN promoter to the plasmid vector that produces the nucleosome structure and transfer it into the cell with HDAC1,Runx2. The results showed that the tendency of HDAC1 to inhibit the activity of OPN promoter mediated by Runx2 was basically the same as that of vector without nucleosome, and the effect of TSA was basically the same. This indicated that the effect of HDAC1 on Runx2 mediated OPN promoter activity was not related to chromatin structure. Then we used immunofluorescence (IF) and immunoprecipitation (Co-IP) experiments to verify the co-localization of HDAC1 and Runx2 in the nucleus and speculated that they might be in the same complex. We further confirmed by CHIP experiments that both HDAC1 and Runx2 can bind to the promoter of OPN. We found that HDAC1 significantly inhibited OPN mRNA level induced by Runx2 by transient transfection of HDAC1 into Runx2 overexpressed cell lines, but interestingly, HDAC1 had no effect on ALP mRNA level. After the enzyme activity of HDAC1 was inhibited by TSA, the level of OPN mRNA induced by Runx2 increased obviously, but the level of ALP mRNA induced by Runx2 did not change. These results suggest that the inhibitory effect of HDAC1 on OPN mRNA level induced by Runx2 is consistent with that of HDAC1 on Runx2 activation of OPN promoter, and this effect has some specificity. Our Western blot results showed that the mRNA level of OPN in osteoblasts increased significantly at the 6th day after induction of osteoblast differentiation, and the HDAC1 protein level decreased at the same time. Moreover, we also analyzed the level of HDAC1 protein in different cell lines, and found that the level of HDAC1 protein decreased gradually with the development of differentiation. These results suggest that HDAC1 may act as an inhibitory barrier during the up-regulation of OPN mRNA by Runx2 and even during the process of Runx2 inducing osteoblast differentiation, and when Runx2 passes through this barrier, HDAC1 can no longer inhibit the expression of OPN, thus promoting the regulation of Runx2. In addition, we also found that HDAC1 had no effect on the protein level of Runx2, while the protein level of Runx2 increased significantly with differentiation, so we speculated that in the process of osteoblast differentiation, There may be an epigenetic regulatory mechanism beyond HDAC1 to regulate the protein level of Runx2, thus affecting the differentiation of osteoblasts. Our studies reveal the molecular mechanism of HDAC1 inhibiting OPN mRNA level induced by Runx2, and provide a theoretical basis for the use of HDACs in the treatment of skeletal diseases.
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.1

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本文编号：2365513