转基因人骨髓间充质干细胞作为组织工程韧带种子细胞的实验研究

发布时间：2018-12-07 16:52

【摘要】：目的严重创伤后的大段韧带组织缺损一直是修复重建外科的难题，目前临床上多采用韧带移植来修复、重建损伤的韧带组织，目前临床使用移植材料较多。其中自体韧带移植临床使用广泛，但由于供体部位功能缺损，手术时间较长，创伤大，及移植后韧带的疤痕愈合等问题使其常无法达到满意的临床效果。组织工程韧带（tissue-engineered ligament，TEL）是目前组织工程研究的热点，作为韧带组织理想的替代物，其具有以下优点：（1）利用支架和种子细胞在体外构建，避免了再次取材给患者带来的痛苦；（2）根据缺损情况进行塑形、构建，对于大段的韧带缺损优点突出；（3）有效降低了免疫反应及力学强度下降问题。 TEL由种子细胞和具有韧带性能的支架复合而成，种子细胞的选择是TEL构成的关键步骤。而其中采用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向肌腱细胞分化的研究是TEL种子细胞研究的热门方向。BMSCs可以通过骨髓穿刺获得，体外易于分离、纯化、培养、扩增，短期内即可获得构建TEL需要的细胞数量。动物研究表明bFGF是韧带愈合过程中重要的生长因子，其可促进韧带的愈合并能诱导BMSCs向韧带细胞方向分化。局部应用重组细胞因子和生长因子，代谢较快，价格较高，且局部免疫反应大，采用基因转染技术能有效克服上述缺点。本研究尝试利用腺病毒载体将bFGF及绿色荧光基因（enhanced green fluorescentprotein，，eGFP）转入h-BMSCs，并评价bFGF的表达情况，及转染后细胞的增殖、分化及产生韧带特异性细胞外基质的表达情况。方法 1．携带人bFGF基因和增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP的构建。（病毒构建由invitrogen公司构建）； 2．人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，h-BMSCs）的分离、纯化、培养、鉴定；（1）骨髓采集及h-BMSCs的分离、纯化：采用髂前上棘穿刺获取10ml骨髓/人，采用梯度离心法和贴壁法结合分离、培养、纯化h-BMSCs。（2）h-BMSCs的鉴定：采用形态学观察、流式细胞仪鉴定单克隆抗体，及三向诱导分化相结合进行h-BMSCs的鉴定。 3．利用Ad.bFGF-eGFP在体外转染h-BMSCs，设正常h-BMSCs及转染空病毒的h-BMSCs为对照组，观察三组细胞的增殖情况及bFGF、韧带特异性细胞外基因的表达和分泌的情况；（1）用Ad.bFGF-eGFP采用50的MOI值体外转染h-BMSCs，通过绿色荧光测定转染效率。三组细胞采用ELISA方法对细胞培养液中bFGF进行定量分析。（2）转染后细胞增殖、多向诱导分化能力及产生韧带特异性细胞外基质的情况：细胞培养过程中每日在相差显微镜下观察细胞形态及增殖情况，采用MTT法绘制生长曲线。用RT-PCR方法定量检测h-BMSCs中Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）、纤维连接蛋白（Fibronectin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）在基因水平的表达。Western-blot半定量检测bFGF对h-BMSCs中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin蛋白水平表达的影响。结果 1．原代培养的h-BMSCs贴壁后细胞开始增殖，细胞由圆形转化为三角形、多角形和梭形，1周后，单克隆细胞集落开始出现，并呈指数增殖，10ml骨髓液分离得到的h-BMSCs在体外培养扩增3周可获取2×107个细胞。 2．分离的h-BMSCs不表达CD29、CD90，表达CD34和/或CD45，在不同的的培养基下，细胞具有出现三向分化潜能：成骨、成脂、成软骨方向诱导分化。 3．携带bFGF基因的腺病毒对细胞有很高的转染效率，当MOI值为50时，细胞转染率高可达到95%以上。转染后采用ELISA检测转染组bFGF表达量较转染Ad.eGFP组及未转染组有显著差异。分泌的峰值出现在转染后第2天，至第7d表达量仍有显著性差异，此后表达逐渐下降，但仍保持在一个可检测水平之上。 4．Ad.bFGF-eGFP转染组h-BMSCs表现为均匀一致的纤维母细胞样细胞表型，呈梭形带有长的细胞突起，细胞密度明显高于两组对照组。Western-blot及RT-PCR方法检测显示转染组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin在蛋白水平及基因水平表达均显著高于对照组。结论 1．h-BMSCs方便获取，穿刺过程对机体创伤小。体外扩增能力强大，10ml骨髓在体外培养三周后即可获取2×107个细胞，可以满足构建TEL所需细胞数量，是构建TEL比较理想的种子细胞。 2. Ad.bFGF-eGFP能够在体外高效地转染h-BMSCs，转染后的h-BMSCs在短时间内较多的表达bFGF蛋白。在bFGF的作用下，h-BMSCs增殖速度明显加快，表形均一并向成纤维细胞表型分化，转染后的h-BMSCs韧带特异性细胞外基质在基因水平及蛋白水平的表达均有显著性增强。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】