结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA相互作用核心区域的研究

发布时间：2018-12-09 09:56

【摘要】：DNA螺旋酶是原核生物细胞存活所必须的基础酶类,是很多抗癌药物(喹诺酮类)和抗生素药物(新生霉素等)的天然作用靶标,在结核病防治中的有非常重要的作用。近年来螺旋酶在探讨基本生命活动和开发设计新型药物等方面成为研究热点。 DNA螺旋酶是由A、B亚基共同组成的二源四聚体,目前关于结核分枝杆菌螺旋酶GyrA与GyrB相互作用研究并不深入,两亚基之间究竟以何种方式重组而具有全酶活性,其机理完全不清楚。本实验室已鉴定出结核分枝杆菌螺旋酶GyrB的Toprim结构域是与GyrA相互作用的关键区域。在此基础上,本课题计划构建GyrB系列缺失突变体,利用酵母双杂交、SPR仪检测等技术分析其与GyrA之间的相互作用,确定GyrB与GyrA相互作用的核心区域,为探明螺旋酶催化机理提供基础,为阐明螺旋酶在结核分枝杆菌生命活动中的调控功能以及结核病新药药物靶标的筛选开发提供依据,并促进结核病的防治。 本课题的主要研究结果为： 1、根据公布的gyrB基因序列,扩增突变体片段gyrB1-518、gyrB1-531、gyrB1-550、gyrB△531-550、gyrB△548-564；将扩增的的突变体基因构建的相应的表达载体pET28a和酵母载体pGADT7上；在GyrB1-564基础上继续构建GyrB1-550,GyrB1-531, GyrB1-518突变体,并表达纯化突变体蛋白质； 2、酵母双杂交、SPR等实验结果证明：缺失C端的GyrB不能与GyrA相互作用,说明GyrB-CTD是其与GyrA相互作用的必需功能结构域。 3、构建α螺旋缺失突变体GyrB△531-550,酵母双杂交等实验结果显示,531-550aaα螺旋的缺失导致GyrB与GyrA之间丧失相互作用活性,α螺旋531-550aa可能是GyrB与GyrA相互作用的一个核心区域。α螺旋531-550aa可能对GyrB二聚体的形成具有重要的意义。 4、构建无规则卷曲缺失突变体GyrB△548-564,酵母双杂交等实验结果显示,548-564aa短肽缺失导致GyrB与GyrA之间相互作用活性减弱,548-564aa短肽可能起到空间上支持Toprimα/β构象的重要作用,并有可能与GyrB上其他功能域配合发挥作用。
[Abstract]:DNA helicase is the basic enzyme necessary for the survival of prokaryotes and is the natural target of many anticancer drugs (quinolones) and antibiotics (neomycin etc.) and plays a very important role in the prevention and treatment of tuberculosis. In recent years, helicase has become a hotspot in the research of basic life activities and the development and design of new drugs. DNA helicase is a dimeric dimer composed of subunits of DNA B. At present, the interaction between GyrA and GyrB of Mycobacterium tuberculosis is not deeply studied, and the way in which the two subunits are recombined to have the whole enzyme activity. The mechanism is completely unclear. The Toprim domain of Mycobacterium tuberculosis helicase GyrB has been identified as the key region of interaction with GyrA in our laboratory. On this basis, we plan to construct a series of GyrB deletion mutants, analyze the interaction between GyrB and GyrA by yeast two-hybrid and SPR detection, and determine the core region of the interaction between GyrB and GyrA. It provides the basis for the study of the catalytic mechanism of helicase, the regulation function of the helicase in the life activities of Mycobacterium tuberculosis and the screening and development of new drug targets for tuberculosis, and promotes the prevention and treatment of tuberculosis. The main results of this study are as follows: 1. According to the published gyrB gene sequence, the amplified mutant gyrB1-518,gyrB1-531,gyrB1-550,gyrB 531-550 gyrB 548-564; The corresponding expression vector pET28a and yeast vector pGADT7 were constructed from the amplified mutant gene, and the GyrB1-550,GyrB1-531, GyrB1-518 mutant was constructed on the basis of GyrB1-564, and the protein of the mutant was expressed and purified. 2. The results of yeast two-hybrid and SPR showed that the missing C-terminal GyrB could not interact with GyrA, indicating that GyrB-CTD was the necessary functional domain for the interaction between GyrB-CTD and GyrA. 3. The construction of 伪 -helix deletion mutant GyrB 531-550 and yeast two-hybrid experiments showed that the deletion of 531-550aa 伪 helix resulted in the loss of interaction activity between GyrB and GyrA. 伪 helix 531-550aa may be a core region of the interaction between GyrB and GyrA, and 伪 helix 531-550aa may play an important role in the formation of GyrB dimer. 4. GyrB 548-564, an irregular crimp deletion mutant, was constructed. The results of yeast two-hybrid experiments showed that the deletion of 548-564aa short peptide resulted in a decrease in the interaction activity between GyrB and GyrA. 548-564aa short peptides may play an important role in spatially supporting the conformation of Toprim 伪 / 尾 and may interact with other functional domains on GyrB.
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

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本文编号：2369193