载脂蛋白AI模拟肽R-D4F对人脐静脉血内皮祖细胞黏附迁移功能的影响

发布时间：2018-12-12 08:25

【摘要】：目的： 建立内皮祖细胞培养方法套路,探索载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对内皮祖细胞黏附、迁移活性的影响。 方法： 1.单个核细胞(MNCs)分离、培养 采用Ficoll-hypaque(葡聚糖—泛影葡胺)密度梯度离心法,从人脐静脉血中分离出MNCS.重悬于EGM-2完全培养基,调整细胞浓度,接种在已包好人纤维连接蛋白的培养皿中。将培养皿置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中静置培养。 2.内皮祖细胞(EPCs)鉴定 细胞培养至20d后,进行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定。在激光共聚焦显微镜下观察细胞吞噬Dil-ac-LDL及膜内表面结合FITC-UEA-I的能力。 3.载脂蛋白A1(APOA1)模拟肽R-D4F对EPCs黏附功能的影响 培养3-4周的EPCs分为5组,分别为DMEM组、D-4F(50μg/ml)组、R-D-4F(5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml)组。加入干预药物后将培养皿置于37℃培养箱中孵育24h。胰酶消化后调整细胞浓度为1×105/ml,接种于人纤维连接蛋白包被的24孔培养板中。每组6孔,每孔500μl。各组随机3孔37℃孵育2h,另外3孔37℃孵育4h。显微镜下每孔随机选择8个视野计数贴壁细胞,取平均值。检测5组细胞的黏附功能有无变化并比较有无统计学意义。 4.载脂蛋白A1(APOA1)模拟肽R-D4F对EPCs迁移功能的影响 用24孔transwell(孔径8μm)行体外迁移实验。培养3-4周的EPCs用胰酶消化后重悬于完全培养基中,调整细胞悬液浓度为1×105/ml。transwell下室先加600μ1EGM-2培养基,再根据分组加入不同的干预药物。上室中加细胞悬液100μl。将24孔板置于37℃培养箱中孵育12h。经固定、染色、洗涤后,每个小室随机选择10个连续显微镜视野(200倍)计数迁移到上室膜下的细胞。 主要结果： 1、MNCs的分离、培养 4d后首次换液,轻轻吸弃未贴壁细胞。一周左右即可见到贴壁细胞小集落,细胞呈长椭圆形。一周后细胞生长明显加速,呈克隆样生长,逐渐出现大面积团簇状生长,细胞呈放射条索状排列。20d左右细胞已基本长满瓶底70-80%,呈典型的铺路石样改变。 2、EPCs的鉴定 细胞双荧光染色鉴定结果：贴壁细胞呈Dil-ac-LDL(红色荧光)、FITC-UEA-I(绿色荧光)双阳性的即为EPCs,阳性率可达90%。 3、APOA1模拟肽对EPCs黏附、迁移功能的影响 与DMEM对照组相比,D-4F显著增强内皮祖细胞的黏附、迁移功能；R-D4F(5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml)呈剂量依赖性的增强内皮祖细胞的黏附、迁移功能。同时,4h组黏附细胞数较2h组多,各项比较有统计学意义。与D-4F阳性对照组相比,同浓度(50μg/ml)的R-D4F比D-4F的促进作用更强,但无统计学意义。 主要结论： 内皮祖细胞(EPCs)易于分离和体外培养扩增,可作为治疗血管损伤性疾病的种子细胞。载脂蛋白A1(APOA1)模拟肽R-D4F对EPCs的生物活性具有正向促进作用,应用于心脑血管疾病的治疗具有一定的可行性。
[Abstract]:Aim: to explore the effect of apolipoprotein A1 mimic peptide R-D4F on adhesion and migration of endothelial progenitor cells. Methods: 1. (MNCs) was isolated from mononuclear cells and MNCS. was isolated from human umbilical vein blood by Ficoll-hypaque (dextran diatrizoate) density gradient centrifugation. Heavy suspension in EGM-2 complete medium, adjust cell concentration, and inoculate in the culture dish covered with human fibronectin. The culture dish was incubated in constant temperature incubator at 37 鈩，

本文编号：2374261