脂肪源性神经干细胞移植治疗老年性聋的实验研究

发布时间：2018-12-18 03:09

【摘要】：老年性聋也称年龄相关性听力损失（ARHL），是指因年龄的增长,听觉器官随同身体其他组织器官一起所发生的缓慢进行性听觉系统老化过程,并出现听力减退的生理现象，属于多基因疾病范畴，，是遗传和环境因素共同作用的结果。随着世界人口老龄化趋势的不断加剧，老年性聋的发病率逐年增高。据WHO统计数据显示：到2025年，老年人口比例迅速增加，全世界60岁以上的人口将达12亿之多，而其中65~75岁的人老年性聋的发病率为70%~80%。老年性聋的发生和发展严重影响老年患者的生活质量。随着老年性聋发病机制研究的日益深入，Welsh在Schuknecht对老年性聋分类的基础上又提出了中枢性老年性聋这一概念,是指各级中枢尤其是大脑初级听皮层神经元凋亡及退行性变是老年性聋的主要发病机制。近年来，为了挽救老年性聋患者的听力，尝试了干细胞移植、药理学干预疗法及基因治疗等多种方法，而干细胞移植治疗是目前具有极大潜在临床应用价值的治疗方法。 Kesser等人不仅使移植到耳蜗的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为毛细胞或螺旋神经节细胞来替代甚至修复外周神经系统发生凋亡和退行性变的细胞，而且提出种子细胞是通过释放GDNF和BDNF等神经营养因子来发挥作用，提示了神经干细胞在老年性聋等神经退行性疾病干细胞移植治疗中发挥了重要作用。目前用于老年性聋移植的细胞主要来源于胚胎期的纹状体、海马、脑皮层、侧脑室的脑室区，但人胚胎组织和人胚胎干细胞的使用始终存在伦理学限制而来源不足，并且异体移植或多或少会存在免疫排斥问题。脂肪源性干细胞(Adipose derived stem cells, ADSCs)可在一定程度上克服上述缺点因此被认为是理想的种子细胞来源。ADSCs可以通过自体取材获得，且具有分离培养较为容易，排斥反应较弱，无致瘤性等特点,已成为一种极有潜力的成体干细胞。针对老年性聋外周神经系统的干细胞移植治疗虽能证实种子细胞可替代丢失的细胞，但移植动物的听功能恢复情况尚不明确。基于目前大量研究表明老年性聋的发生是外周神经系统和中枢神经系统联合降低衰变的结果，以中枢神经系统神经元的凋亡和退行性变为主。本研究将ADSCs在特定生长因子的作用下诱导分化为NSCs后移植到老年性聋动物模型C57BL/6J小鼠初级听皮层，观察此方法对ADSCs向NSCs诱导分化的影响。应用透射电镜技术、HE染色法和Tunel-POD法比较年轻组（2月龄）和老年组(10月龄)小鼠干细胞治疗前初级听皮层形态学差异及治疗前后初级听皮层神经元凋亡率的变化。在此基础上应用免疫组织荧光技术检测移植的种子细胞在受体组织中的存活、迁移和分化程度，并进一步检测了小鼠听功能恢复情况。本研究分为三个部分：第一部分C57BL/6J小鼠脂肪源性干细胞的分离、培养及鉴定【目的】严格无菌条件下分离得到C57BL/6J小鼠附睾脂肪垫组织，进行ADSCs体外培养和鉴定，探索新的干细胞移植治疗来源。【方法】选取体重约15g~16g的C57BL/6J小鼠，切开腹部皮肤后获取附睾脂肪垫组织，I型胶原酶消化法分离、贴壁培养得到ADSCs，胰蛋白酶消化法传代扩增。传至第三代的ADSCs分别行流式细胞学检测细胞表型(CD45, CD90, CD105)及免疫荧光技术检测其特异性标志物纤连蛋白(fibronectin)。【结果】附睾脂肪垫组织在体外贴壁培养能够得到大量长梭形ADSCs，经传代后仍具有较强的增殖能力；细胞表面标志物CD90、CD105表达强阳性，CD45表达阴性；经fibronectin鉴定为ADSCs。【结论】附睾脂肪垫组织在体外贴壁培养可获得大量ADSCs，易于传代扩增，可作为新的干细胞移植治疗的种子来源。第二部分脂肪源性干细胞诱导分化为神经干细胞的体外研究【目的】探讨诱导ADSCs分化为NSCs的体外培养方法，为细胞移植修复神经系统损伤及退行性变提供种子细胞。【方法】贴壁培养的C57BL/6J小鼠(附睾脂肪垫)ADSCs，进行流式细胞术表型鉴定及标志物fibronectin鉴定后，在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、2%B27的Neurobasal培养基中诱导成NSCs。用免疫荧光技术进行NSCs特异性标记物巢蛋白(Nestin)、增殖能力5’-溴尿嘧啶(BrdU)及多向分化潜能检测。【结果】诱导后的干细胞球经Nestin及Brdu鉴定为NSCs，且具有较强的增殖能力；NSCs在体外分化后产生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)阳性的神经元以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞。【结论】ADSCs可在特定生长因子作用下被成功诱导为NSCs，为细胞移植修复神经系统损伤及退行性变奠定了基础。第三部分脂肪源性神经干细胞移植治疗老年性聋的体内研究【目的】脂肪源性神经干细胞移植治疗老年性聋动物模型C57BL/6J小鼠后，种子细胞在体内的存活、迁移及分化情况及对C57BL/6J小鼠听觉功能的影响。【方法】ADSCs诱导而来的NSCs立体定向注射入年轻组和老年组C57BL/6J小鼠初级听皮层，注射后从免疫荧光化学、病理学、电生理学方面分别检测ADSCs诱导而来的NSCs在体内的存活及分化情况、注射前及注射后2w、3w、4w，Tunel-POD法检测初级听皮层神经元凋亡情况、听性脑干反应(ABR)检测小鼠听功能变化. 【结果】C57BL/6J小鼠进行脂肪源性神经干细胞移植治疗后2w、3w种子细胞可在体内存活并分化为β微管蛋白(β-TubulinⅢ)阳性的神经元，但是第3w以后存活细胞数量逐渐减少，至第四周时已基本检测不到移植细胞；老年组治疗后初级听皮层神经元凋亡率较治疗前明显减少、治疗后2w、3w听功能较治疗前有较明显提高，但治疗3w后听力提高差异不大甚至有所下降至第4w时已无差异；年轻组小鼠治疗前后初级听皮层神经元凋亡率及听功能较治疗前无显著差异。【结论】脂肪源性神经干细胞通过在体内分化以替代和修复老年性聋动物模型C57BL/6J小鼠初级听皮层凋亡神经元而促进老年性聋小鼠听功能恢复。本研究探索了一种新的老年性聋干细胞移植治疗方法。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】