磁刺激引起神经元突触生长及迁移的机制研究

发布时间：2018-12-23 18:36

【摘要】：背景及目的：近年来许多的动物实验发现重复经颅磁刺激（Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS）治疗缺血性脑损伤，能促进受损神经细胞轴突再生、改善神经轴突重塑的作用、促进内源性神经细胞迁移并最终改善神经损伤后的功能恢复，但具体机制尚不明确。本实验目的1：体外培养原代神经元细胞，建立神经细胞缺氧缺糖（Oxygen/Glucose Deprivation）模型，体外模拟脑缺血缺氧，应用MTT方法检测磁刺激对缺血缺氧神经细胞存活率的影响，应用LDH（乳酸脱氢酶）的释放量检测磁刺激对缺血神经细胞有无损伤，免疫细胞化学方法及RT-PCR方法检测磁刺激缺血神经元后Robo2和RhoA的表达变化，离体研究磁刺激对大鼠缺血缺氧神经元的轴突再生、细胞活性和RhoA信号通路活动的影响，探讨其可能机制。2：体外培养原代神经元细胞，transwell小室体外模拟内源性神经元细胞的迁移，观察磁刺激对神经元细胞迁移的影响。 方法(第一部分)： 1.选取无菌分离15-18天胎龄SD胎鼠，，原代培养大鼠皮质神经元细胞。 2.取体外培养第6天SD胎鼠皮质神经元细胞免疫细胞化学方法鉴定。 3.原代皮质神经元接种培养板中，分组：(1)正常组(control，C)；(2)缺氧缺糖(Oxygen/Glucose Deprivation,OGD)组；(3)假刺激(shame，S)+缺氧缺糖组；(4)40%最大刺激强度(40% of maximum intensity of stimulation，M1)+缺氧缺糖组；(5)60%最大刺激强度(60% of maximum intensity ofstimulation，M2)+缺氧缺糖组。 4.于第6d MTT检测细胞存活率，LDH释放量检测细胞损伤程度，免疫细胞化方法检测各组细胞Robo2、RhoA的阳性表达，应用RT-PCR检测各组Robo2、RhoA表达量的变化。 5.细胞接种后第2d开始磁刺激，每天于固定时间刺激，3串/d，100次/串，每串间隔时间1min，连续刺激5d，频率1HZ。 方法(第二部分)： 1.选取无菌分离15-18天胎龄SD胎鼠，原代培养大鼠皮质神经元细胞。 2.取体外培养第6天SD胎鼠皮质神经元细胞免疫细胞化学方法鉴定。 3.原代皮质神经元接种于transwell小室，分组：正常组、假刺激组、40%最大刺激强度组、60%最大刺激强度组；于第6d结晶紫染色迁移出的细胞。 4.细胞接种后第2d开始磁刺激，每天于固定时间刺激，3串/d，100次/串，每串间隔时间1min，连续刺激5d，频率1HZ。 结果(第一部分)： 1.皮质神经元细胞离体培养6天，神经细胞清晰可见，细胞贴壁良好，胞体较大，呈圆形、多极形，胞体折光性强，神经突起相互联络成网。用NeuN（神经元特异核蛋白）免疫细胞化学染色作分类计数，阳性神经细胞约占(93.7土5.5)%。 2.镜下观察缺氧缺糖组细胞：OGD 30 min内，神经细胞形态较正常组无明显变化；OGD 60min时，部分细胞皱缩、胞膜崩解、折光性差，LDH的释放量明显增加(P0.05)。 3.缺氧缺糖再灌注损伤后，OGD模型组的神经细胞存活率较对照组显著降低(P0.05)，而Robo2、RhoA的表达及细胞LDH释放量较对照组显著升高(P0.05)。假刺激组的细胞存活率、LDH释放量、Robo2及RhoA的表达较OGD/R模型组无明显变化(P0.05)，40%最大强度刺激组、60%最大强度刺激组的细胞存活率、Robo2的表达较OGD/R模型组明显增加(P0.05)，40%最大强度刺激组、60%最大强度刺激组的LDH释放量、RhoA的表达较OGD组明显下降(P0.05)。 结果(第二部分): 结晶紫染色transwell小室迁移出的细胞，结果显示：胞体、胞核均呈紫色，正常组、假刺激组迁移出的细胞数量无明显差别(P0.05)，40%最大强度刺激组、60%最大强度刺激组较正常组及假刺激组迁移出的细胞数量明显增加(P0.05)。 结论： (l)磁刺激能提高缺氧缺糖神经元的存活率，降低缺氧缺糖神经元LDH的释放，对缺氧缺糖神经元有直接的神经保护作用。(2)高强低频磁刺激通过促进Robo2表达的上调,而促进受损神经元轴突再生。(3)高强低频磁刺激能抑制受损神经元RhoA的表达，可能是磁刺激促进轴突再生的机制之一。(4)高强低频磁刺激能促进体外神经细胞迁移。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE: In recent years, many animal experiments have found that repeated transcranial magnetic stimulation (rTMS) is used to treat ischemic brain injury, and can promote the axonal regeneration of damaged nerve cells and improve the role of nerve axon remodeling. The mechanism of promoting the migration of endogenous nerve cells and ultimately improving the function of nerve injury is not clear. Objective: To study the effects of magnetic stimulation on the survival rate of hypoxic-ischemic neurons in cultured primary neuronal cells in vitro, in order to establish an oxygen-deficient (Oxygen/ Gluctose Department) model of nerve cells, to simulate the cerebral ischemia and hypoxia in vitro, and to use the MTT method to detect the effect of magnetic stimulation on the survival rate of the ischemic and hypoxic cells. The effects of magnetic stimulation on the expression of Robo2 and RhoA following the magnetic stimulation were detected by the release of LDH (lactate dehydrogenase), and the changes of the expression of Robo2 and RhoA were detected by the method of immunocytochemistry and RT-PCR. The effect of magnetic stimulation on the cell migration of the neurons was observed in vitro, and the effect of magnetic stimulation on the migration of the neurons was observed. Method (Part 1): 1. Select sterile separation of 15-18 days of fetal-age SD rat, and primary culture of the cortical neurons of the rat Cell. 2. Immunocytochemical method for the in vitro culture of the 6-day SD rat cortical neuron cell Identification. 3. Primary cortical neurons were inoculated into a culture plate with a group of (1) a normal group (control, C); (2) a hypoxia-deficient (OGD) group; (3) a sham, S, and a hypoxia-deficient group; (4) a maximum intensity of stimulation of 40% (40% of maximum intensity of stimulat ion,M1)+缂烘哀缂虹硸缁勶紱(5)60%鏈

本文编号：2390099