汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定

发布时间：2018-12-25 12:42

【摘要】：肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠类为主要传染源的一种自然疫源性疾病，，又称流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF），简称出血热。全球每年新发病例有90%左右在中国；死亡率在2%~10%左右。该病在我国绝大多数省区流行，病情危急，危害很大。汉滩病毒（hantaan virus， HTNV）和汉城病毒（Seoul virus， SEOV）是我国HFRS的两种主要病原体。汉坦病毒感染可引起机体明显的适应性免疫应答。体液免疫应答强烈而持久；细胞免疫可能在免疫保护和免疫病理损伤两方面都有作用。汉坦病毒核蛋白是诱导体液免疫应答主要的免疫原，可在发病数天内引起抗体应答。因此，重组核蛋白常被用来检测患者血清中病毒特异性抗体的类型和水平，为HFRS的诊断提供依据。糖蛋白免疫原性较弱，糖蛋白特异性抗体出现稍晚，多在病程中后期。但是，一般认为汉坦病毒糖蛋白是诱导中和抗体产生的主要来源；而据报道，中和抗体出现的早晚与患者的病情及预后密切相关。人感染汉坦病毒后，血清病毒特异性IgG水平随时间延长不断升高，一般于恢复早期达到平台期；持续时间长，有时在病愈后数十年仍可检测到。抗体的产生离不开抗原特异性B细胞的活化、增殖、分化；抗原特异性B细胞接触并结合抗原是体液免疫应答的始动环节；而这离不开B细胞受体（B cell receptor, BCR）对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇（antigenic determinants），又称表位(epitope)。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。研究汉坦病毒结构蛋白特异性抗体识别的B细胞表位对于深入认识病毒致病和抗体产生机制，中和抗体的免疫保护作用，以及研发新的诊断材料、亚单位疫苗等具有重要意义。目前，有关汉滩病毒结构蛋白B细胞表位的报道较少，尚缺乏系统的研究。本论文首次采用合成的重叠多肽对HFRS患者血清抗体识别的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）线性B细胞表位进行了系统分析。把覆盖HTNV NP氨基酸全序列的70条重叠15肽包被于ELISA板，用间接ELISA法筛选了35例HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位，并用竞争ELISA证实了患者血清抗体与抗原肽结合的特异性。发现HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次为NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部仅有数个线性B细胞表位。发现一些患者血清抗原肽特异性IgG水平在急性期可有不同的变化。同时，我们合成了覆盖HTNV GP氨基酸全序列的281条重叠15肽，利用间接ELISA和点杂交两种PepScan法对3D8、3G1、8G3这3株鼠源性中和抗体识别的B细胞表位进行表位作图。首先，将合成的281条重叠多肽分成28组，每10条肽为一组，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株单克隆抗体做粗筛；然后将与单克隆抗体呈阳性反应的混合肽中各组成肽分别包被ELISA板或NC膜继续用单克隆抗体反应，做细筛，从而确定各单克隆抗体识别的抗原肽。然后用竞争ELISA证实抗原肽与中和抗体结合的特异性。我们发现单克隆抗体3D8和8G3识别HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而单克隆抗体3G1可能识别由数个线性肽组成的构象表位。由于原合成肽相邻肽间相差4个氨基酸残基，因此又追加合成了与881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分别相差3个、2个、1个氨基酸残基的15肽。将这些肽包被于ELISA板或NC膜上与单克隆抗体3D8反应，进行单克隆抗体3D8识别线性B细胞表位的精细定位。我们发现单克隆抗体3D8与882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反应最强烈。接着，用丙氨酸扫描突变法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896这条抗原肽发挥主要作用的氨基酸残基，发现aa885C、aa896C是该抗原肽表位最关键的氨基酸残基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K对单克隆抗体3D8识别这个抗原肽表位也有重要影响。本论文首次系统分析了肾综合征出血热患者血清抗体识别的HTNV核蛋白线性B细胞表位，对具有中和作用的单克隆抗体3D8的B细胞表位作图确定了汉滩病毒糖蛋白上一个新的中和表位。这一结果不仅为深入探讨HTNV感染引起的体液免疫应答规律以及研制新型疫苗提供了理论依据，同时为搞清单克隆抗体3D8作为HFRS治疗性抗体的抗病毒感染机制提供了重要的实验依据。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】