小鼠骨髓源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定

发布时间：2019-01-04 15:15

【摘要】：目的：树突状细胞（dendritic cells,DC）是迄今为止人类发现的唯一能够刺激初始T细胞的活化增殖和功能最强大的抗原提呈细胞（antigenpresenting cell,APC），其可介导抗原转移，在体内激活静息T细胞，启动特异性免疫应答。多发性硬化（muitiple sclerosis,MS）是主要以T细胞介导的中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病，它的发病机制虽然仍未得到完全明确，但众多研究表明，MS的发生与T细胞异常活化有关，并且，MS的病理免疫应答与DC的参与有直接关系。基于DC的特性，近年来，将DC用于自身免疫性疾病的研究已得到深入开展，特别是将其应用于多发性硬化的治疗已成为目前的研究热点。因此，能够正确、高效的分离培养出DC并对其进行鉴定是运用DC开展下游实验的基础与前提。我们设计了本实验，旨在用rmGM-CSF、rmIL-4及TNF-α在体外诱导培养小鼠骨髓源成熟树突状细胞与免疫磁珠分离纯化相结合的方法获得DC并对DC从形态学观察、细胞表面分子的检测及刺激T细胞增值能力三方面进行鉴定，探讨及优化小鼠骨髓源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定方法，为进一步研究DC在多发性硬化治疗方法中的应用提供实验基础。方法: 1.骨髓源性成熟DC的分离及培养将Ｃ57BL/6小鼠用拉颈法处死后浸泡在75%乙醇中3-5分钟，无菌取出下肢骨，用注射器针头在长骨两端扎眼使髓腔联通，用注射器吸少量RPMI-1640培养液将骨髓冲出，用200目滤网过滤后加入红细胞裂解液溶解红细胞，RPMI-1640培养液洗涤细胞，然后用RPMI1640完全培养液（含10%胎牛血清、rmGM-CSF（10ng/ml）、rmIL-4(10ng/ml)）调整细胞浓度至106/ml，接种于6孔培养板中，将细胞培养板放入37oC、含5%CO2的培养箱中培养，第6天加入rmTNF-α(15ng/ml)至细胞培养板中并继续培养，至第7天收集细胞培养板中所有的悬浮细胞，此即为小鼠骨髓源性的成熟DC。 2．CD11c免疫磁珠分离纯化DC： 2.1使用CD11c免疫磁珠标记DC：对DC进行计数，重悬于缓冲液中。加入CD11c免疫磁珠，于2--8oC孵育15分钟后重悬于缓冲液中。 2.2使用磁珠分选器分离DC：将LS柱放置在MiDi MACS磁珠分选器中，加入适量缓冲液润洗LS柱。将磁珠标记的细胞悬液放入分选柱中，收集流出物，这是未标记的阴性细胞。将分选柱从分选器上移下，加入5ml缓冲液，用配套活塞将标记细胞推出来，，此即为纯化后的成熟DC。 3.小鼠骨髓源成熟树突状细胞的鉴定 3.1细胞形态学观察 3.1.1在倒置荧光显微镜下对DC形态进行观察。 3.1.2扫描电镜对DC形态进行观察并拍照。 3.1.3透射电镜观察并拍照。 3.2流式细胞仪检测细胞表面分子：收集细胞培养板中的悬浮细胞，经离心、洗涤、计数、定容、标记后分别加入抗体，室温避光孵育20分钟后离心、洗涤后使用流式细胞仪检测DC表面CD11c、CD80、CD86、MHCII分子的表达情况。 3.3采用细胞增殖检测试剂（CCK-8）法测定单向混合淋巴细胞反应（one-way MLR）中的DC对同种异基因T细胞刺激增殖的能力：（1）取Ｃ57BL/6小鼠骨髓中的成熟DC作为刺激细胞，方法同前。（2）提取BALB/c小鼠脾脏中的T细胞作为反应细胞，并取部分T细胞做分选前流式检测（3）采用CD90免疫磁珠分离纯化T细胞。（4）流式细胞仪检测T细胞纯度。（5）DC与T细胞共培养：DC与T细胞的比例分别设定为1：5、1:10、1:20、1:40，共培养72小时，于培养结束前4小时加入CCK-8，每孔20μL，继续培养4小时并于加入CCK-8后的第2、3、4小时分别上酶联检测仪检测一次，记录吸光度值。结果: 1.成熟DC的形态观察 1.1倒置荧光显微镜观察：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、rmIL-4诱导培养48小时可见大部分细胞贴壁生长，细胞形态大小不等，培养72小时后悬浮细胞较前增多，部分细胞形成集落。培养第6天可见悬浮细胞继续增多，并可见少量树突样突起。加入rmTNF-α培养24小时后细胞表面出现典型的树枝样突起，完全符合典型成熟DC的形态。 1.2扫描电镜下观察：DC形态多样，结构完整，表面粗糙，好似覆盖着一层薄纱，细胞表面粗糙，有大量褶皱及树枝样突起，符合典型的成熟DC的形态。 1.3透射电镜观察：DC胞体较大，形状不规则，细胞表面有较长的树枝状突起，长短不一，粗细不均；胞核形态多样，可见清晰的核膜；胞浆内细胞器丰富，可见大量的高尔基体、内质网、线粒体及核糖体，但囊泡状结构及溶酶体减少。 2.流式细胞仪检测DC表面分子：小鼠骨髓源成熟树突状细胞高表达CD11c，纯度大于90%。细胞表面CD80（94.73%±1.45%）、CD86（96.43%±2.00%）、MHCII（94.13%±5.86%），均呈高表达，符合成熟DC的表达特征。 3.DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力：磁珠分选后的小鼠T细胞经流式检测其纯度大于90%，各小时组、各DC：T细胞比例的刺激指数均能说明DC有刺激同种异基因T细胞增殖的能力，但在加入CCK-8后的第2、3小时分别检测其各相邻DC：T细胞比例的刺激指数无统计学差异；第4小时DC刺激T细胞增殖的能力与DC所占比例呈正比，各组间差异有统计学意义（P0.05）。结论: 1.本实验利用GM-CSF、IL-4及TNF-α体外诱导培养与免疫磁珠分离提纯相结合的方法成功培养并扩增出高纯度的成熟DC，利用此方法培养出来的成熟DC具有典型的树突状形态，数量大，纯度高。 2.通过形态学观察、细胞表面因子流式学检测及单向混合淋巴细胞反应三方面对细胞进行了鉴定，证明其为成熟的DC。在测定单向混合淋巴细胞反应中DC对T细胞刺激增殖能力时，我们用CCK-8法替代了传统的MTT法，使得实验结果更加稳定、可靠，实验结果还证明利用CCK-8法最佳测定时间是在加入CCK-84小时后，且DC刺激T细胞增殖的能力与DC所占比例成正比。 3.本实验对小鼠骨髓源成熟树突状细胞的体外分离培养、纯化及鉴定进行了探讨，为研究DC的功能及其在多发性硬化等免疫疾病治疗中的应用提供实验基础。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】