高表达AhR的RAW264.7细胞株的构建及对炎症细胞因子调控的研究

发布时间：2019-01-10 07:04

【摘要】：目的构建稳定高表达芳香烃受体(AhR)的小鼠RAW264.7细胞株,观察AhR对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症细胞因子表达的影响。方法构建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重组质粒载体并获得病毒上清,感染RAW264.7细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达的单克隆细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况,qRT-PCR和Western blot法验证AhR基因及蛋白水平表达情况。qRT-PCR和ELISA检测LPS刺激后炎症细胞因子的表达情况。结果获得1株稳定高表达AhR的RAW264.7细胞,荧光显微镜和流式细胞仪显示其荧光率达100%,qRT-PCR和Western blot结果表明RAW/AhR稳转组相对于RAW/Vector空转组,AhR的m RNA和蛋白水平明显上调(P0.05)。LPS刺激后炎症相关细胞因子表达升高,相对于空转组,稳转组的促炎细胞因子IL-6、IL-1β的表达更低(P0.05),抗炎细胞因子IL-10的表达更高(P0.05)。结论成功构建稳定表达AhR的RAW264.7单克隆细胞株,证实了AhR对LPS刺激的巨噬细胞炎症反应具有负性调控作用,为后续进一步研究巨噬细胞中AhR的免疫调节及其他功能奠定基础。
[Abstract]:Objective to construct a mouse RAW264.7 cell line with high expression of aromatics receptor (AhR) and observe the effect of AhR on the expression of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods Lentivirus recombinant plasmid vector containing AhR-Flag-EGFP gene was constructed and virus supernatant was obtained. After infection with RAW264.7 cells, stable expression monoclonal cell lines were obtained by purine mycin screening. The expression of green fluorescent protein was detected by fluorescence microscope and flow cytometry, the expression of AhR gene and protein was confirmed by qRT-PCR and Western blot, and the expression of inflammatory cytokines after LPS stimulation was detected by qRT-PCR and ELISA. Results A stable RAW264.7 cell line with high expression of AhR was obtained. Fluorescence microscopy and flow cytometry showed that the fluorescence rate of RAW264.7 cells was 100%. The results of RT-PCR and Western blot showed that the stable transformation group of RAW/AhR was relative to the empty group of RAW/Vector. The level of m RNA and protein of AhR was significantly up-regulated (P0.05). The expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6,IL-1 尾) in stable group was lower than that in control group (P0.05). The expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 was higher (P0.05). Conclusion the successful construction of RAW264.7 monoclonal cell lines stably expressing AhR has proved that AhR has a negative regulatory effect on the inflammatory response of macrophages stimulated by LPS, which lays a foundation for further study on the immunomodulation and other functions of AhR in macrophages.
【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室;重庆医科大学附属第一医院检验科;
【基金】：国家自然科学基金项目(81671906) 第三军医大学成果转化基金项目(2016XZH11) 创伤烧伤与复合伤国家重点实验室开放课题(SKLKF201601)
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 庞战军,周玫,陈瑗;氧化剂对RAW264.7细胞M-CSF基因表达的调控[J];中国病理生理杂志;2001年01期

2 张同欣;胡厚源;永福;;肝X受体激动剂对RAW264．7细胞摄取Ac-LDL能力的影响[J];中国药师;2007年02期

3 白生宾;陈红香;钟近洁;冯树梅;李甜;罗学港;;MTT法检测RAW264.7细胞活力及可能因素分析[J];中国现代医学杂志;2011年23期

4 孙小娜;张亚楼;张东辉;白生宾;李建瑛;是文辉;董翔;李佳佳;许琴;钟近洁;;NaF对RAW264.7细胞活力的影响[J];疾病预防控制通报;2014年04期

5 ;Lipoxin A_4 negatively regulates lipopolysaccharide-induced differentiation of RAW264.7 murine macrophages into dendritic-like cells[J];Chinese Medical Journal;2007年11期

6 姬文婕;胡道川;陈雪芬;马永强;卢芮伊;周欣;魏路清;;干扰盐皮质激素受体基因对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响[J];中国病理生理杂志;2012年12期

7 白庆霞;杨博;张艳;刘晓静;陆群;;Toll样受体4在RAW264.7细胞中的表达及作用机制的初步研究[J];实用口腔医学杂志;2013年03期

8 刘梅冬,张华莉,肖卫民,刘瑛,王秋鹏,王慷慨,肖献忠;转染HSP70基因对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤的影响[J];医学临床研究;2004年10期

9 张芸;赵中夫;;LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究[J];长治医学院学报;2008年04期

10 李佳;张志仁;姜曼;孙怡;傅晓岚;吴玉章;;MicroRNAs途径在RAW264.7细胞中作用的初步研究[J];免疫学杂志;2012年03期

相关会议论文 前8条

1 Shuhua Cui;Qinhui Tuo;DuanFang Liao;;Effect of Daxx on apoptosis of RAW264.7 cells induced by cholesterol:model of β-cyclodextrin[A];第11届全国脂质与脂蛋白学术会议论文汇编[C];2012年

2 柳忠辉;李楠;葛敬岩;崔雪玲;;单核巨噬细胞系RAW264,7细胞肿瘤模型鼠的建立[A];2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会论文集[C];2012年

3 聂建巍;杨蓉娅;丛林;王文岭;夏志宽;李海涛;;IFN-γ对小鼠RAW264.7巨噬细胞吞噬、杀伤T.asahii的增强作用[A];2012全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2012年

4 程秀丽;丁帆;闫莉;谷婧丽;郝维;高雪;曹济民;;促离子型谷氨酸受体介导RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年

5 陆红玲;赵凯;卫涛涛;;Expression of inducible nitric oxide synthase potentiates the respiratory burst in RAW264.7 macrophages[A];全国自由基医学与毒理学学术交流大会论文（摘要）集[C];2011年

6 陈旭林;郭峰;王飞;王永杰;;不同浓度的AngⅡ对RAW264.7巨噬细胞AT1受体表达的影响[A];第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编[C];2009年

7 孟庆阳;史册;郑嵘;刘娜;吴立鹏;孙宏晨;;白细胞介素-24通过JAK-STAT信号通路对RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨向分化调控机理的研究[A];第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编[C];2014年

8 陈旭林;郭峰;王飞;王永杰;;AngⅡ刺激RAW264.7巨噬细胞AT1受体表达的时间效应[A];第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编[C];2009年

相关博士学位论文 前2条

1 王晓慧;1.抑制糖皮质激素受体表达导致小鼠巨噬细胞系RAW264.7增殖加快的分子机制　2.非基因毒应激对RhoB的诱导作用及其生物学意义[D];第二军医大学;2005年

2 栾弘;泛福舒通过TLR4和TLR2介导的ERK1/2/NF-κB通路上调RAW264.7细胞炎症因子的表达[D];华中科技大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 彭静静;Rac1载体的构建及其对RAW264.7细胞生物学作用的影响[D];江苏大学;2017年

2 方陈城;ZMP1调节RAW264.7自噬的初步研究[D];重庆医科大学;2017年

3 胡光磊;GAS对巨噬细胞株RAW264.7功能的影响[D];河北医科大学;2009年

4 张珈宁;大肠杆菌脂多糖刺激RAW264.7细胞条件下CD40的作用机制[D];海南大学;2014年

5 易睿;Cyclophilin A通过与Caveolin-1协同作用抑制RAW264.7细胞胆固醇蓄积[D];南华大学;2011年

6 乔静;葫芦素E对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制作用及其机制研究[D];暨南大学;2013年

7 何妲;人羊膜上皮细胞干预脂多糖诱导RAW264.7细胞向M1极化及其机制初步研究[D];中南大学;2014年

8 李越;炎症、高脂状态下Api6对小鼠巨噬细胞RAW264.7胆固醇转运的影响[D];重庆医科大学;2011年

9 吴丽媛;TAK1介导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的实验研究[D];天津医科大学;2012年

10 张英林;转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因作用的研究[D];吉林大学;2013年

，

本文编号：2406027