大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、诱导转化为成纤维细胞的实验研究

发布时间：2019-01-27 12:34

【摘要】：盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction, PFD)是中老年女性常见病,发病率约40%,主要包括盆底器官膨出(pelvic organ prolapsed, POP)和压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)。多数研究认为PFD盆底结缔组织中总胶原含量下降,并认为是胶原纤维数量的减少导致了韧带、筋膜等支持结构的松弛,最终导致PFD的发生。目前关于PFD的治疗主要有保守治疗和手术治疗,保守治疗适用于病情较轻的患者,手术治疗又分传统手术和新的手术方式治疗,新手术方式应用生物材料重建盆底的支持结构,相比传统术式局部损伤小,复发率低,但存在易感染,植入网片易侵蚀、外漏、排异等问题。随着组织工程学的发展,为PFD的治疗提供了新思路。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)来源于中胚层,具有很强的自我复制和多向分化潜能,能产生具有各种表型的子代细胞。BMSCs在体内、外不同的诱导条件下,具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力。另外,BMSCs获取相对简便,且可从自身获取,对体外培养条件要求不高,分裂增殖能力强,具有无异体排斥反应、生物相容性好等多种优点。此发现为组织工程中自体BMSCs替代韧带成纤维细胞的应用提供了理论依据。目的探讨在体外条件下大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的培养及诱导分化为成纤维细胞的方法。本实验采用条件培养液直接诱导大鼠BMSCs向韧带成纤维细胞转化,为韧带组织工程构建中种子细胞的选择提供依据。研究方法 (1)利用差速贴壁法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞；通过形态学方法与流式细胞仪检测细胞表面抗原表达的方法,对在体外培养的rBMSCs进行鉴定；并将其向成骨细胞、成脂细胞诱导证实分化潜能。 (2)用条件培养液(LG-DMEM含10%的胎牛血清、10ug/L bFGF、1 mmol/L磷酸维生素C、0.04 mmo/L脯氨酸)进行细胞诱导,对第3代细胞诱导分化3天、6天,使之分化为成纤维细胞后行生长曲线测定,证实其诱导后增殖能力；应用免疫细胞化学法和免疫蛋白印迹法(Western-blot)检测其Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。 (3)所有数据均用均数±标准差表示,在免疫细胞化学染色和Western-blot的结果处理中,采用one-way ANOVA检验样本与对照组之间的组间差异,以α=0.05为检验水准。结果 (1)利用差速贴壁法获得rBMSCs具有干细胞的形态学特征(核浆比大)；流式细胞仪鉴定结果：BMSCs高表达骨髓间充质干细胞表面标志CD90(98.9%)、CD44(98.6%),而造血干细胞标志CD34(1.8%),单核细胞标志CD45(3.6%)均为阴性；r BMSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。 (2)诱导后的BMSCs细胞分裂活跃。MTT法检测两组之间A值差异具有显著性(P0.05)。 (3)条件培养液诱导3天,免疫细胞化学法和Western-blot检测胶原合成,BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。 (4)条件培养液诱导6天,免疫细胞化学法和Western-blot检测胶原合成,BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白的表达与对照组相比增高均有显著差异(P0.05)。结论 (1)从大鼠骨髓中成功获取高分化潜能的BMSCs,差速贴壁法分离获取的BMSCs纯度较高,具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。 (2)在体外经条件培养液诱导下,可促进BMSCs的增殖,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成,顺利转化为成纤维细胞。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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